蠶蛹ACE抑制肽的制備及其ACE抑制活性的研究.pdf

1、柞蠶(AnthereapernyiGuerin.Meneville),又稱家蠶,原產(chǎn)中國,以柞樹葉為食料的吐絲結(jié)繭的經(jīng)濟昆蟲,屬鱗翅目,大蠶蛾科。蠶蛹(silkwormpupa),又名“小蜂兒”,是家蠶生命周期中的一個發(fā)育階段,是繅絲工業(yè)的主要副產(chǎn)物。我國是世界上最主要的蠶絲生產(chǎn)國,每年可產(chǎn)鮮蠶蛹五十萬噸以上。2001年中國國家經(jīng)貿(mào)委發(fā)布的《繭絲綢行業(yè)“十五”規(guī)劃》中預計到到2015年,蠶繭產(chǎn)量將超過60萬t,生絲年產(chǎn)量將達到8萬t以上

2、。在2010年,我國蠶繭產(chǎn)量已經(jīng)超過64萬t,創(chuàng)歷史新高。通?？壷?t生絲可得1t干蠶蛹,蠶蛹產(chǎn)量非?？捎^。由于缺乏深加工技術(shù),大量蠶蛹基本上都用作飼料和肥料,資源利用率和附加值低。干蠶蛹的粗蛋白質(zhì)含量高達45%～50%,油脂含量20%～30%,蠶蛹油約含有75%的不飽和脂肪酸和20%的飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸主要由油酸、亞油酸和亞麻酸組成,飽和脂肪酸主要為棕櫚酸和硬脂酸。蠶蛹中還含有多種維生素(維生素A、維生素B、維生素D等),微量元

3、素(鐵、鋅、硒等)以及少量粗纖維、幾丁質(zhì)、甲殼素、抗菌肽、激素、溶菌酶、多糖等。蠶蛹蛋白質(zhì)經(jīng)測定含有18種人體所需的氨基酸,蠶蛹中常見的17種氨基酸占總氨基酸質(zhì)量分數(shù)的34.57%。因此,綜合開發(fā)利用蠶蛹資源具有重要的意義和非常廣闊的前景。
　　 本文的研究工作主要側(cè)重于脫脂蠶蛹蛋白制備ACE抑制肽及其純化方面。首先從蠶蛹脫脂蛋白的酶解入手,選擇合適的蛋白酶,進行單因素試驗,再通過Box-Behnken設(shè)計響應面優(yōu)化試驗,然后依

4、次采用大孔樹脂、葡聚糖凝膠、半制備液相色譜技術(shù)對蠶蛹ACE抑制肽進行分離純化,最后得到其氨基酸序列,這為人工合成ACE抑制肽提供了實驗依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)蛋白水解酶選擇試驗
　　 本試驗選擇中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶、胰蛋白酶6種蛋白酶進行脫脂蠶蛹蛋白的酶解效果試驗,以DH和ACE抑制率作為考察指標,最后得出堿性蛋白酶制備的抑制肽ACE抑制率最高,達到32.46%。因

5、此,選擇堿性蛋白酶作為試驗用酶。
　　 (2)脫脂蠶蛹蛋白酶解技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化試驗
　　 在優(yōu)化試驗之前進行了底物濃度、溫度、時間、加酶量、pH的單因素試驗,得出其較佳的值,在此基礎(chǔ)上再進行Box-Behnken響應面試驗,最后得出其最佳的酶解技術(shù)參數(shù):底物濃度11.88%,溫度50.22℃,pH9.46,加酶量7.03%,酶解4h后經(jīng)冷凍干燥,在此條件制備的酶解產(chǎn)物的IC50為1.32mg.mL-1,其曲線方程:y=-9

6、.83747x2+40.42596x+13.61453(R2=0.9868)。
　　 (3)大孔樹脂分離純化蠶蛹ACE抑制肽的試驗
　　 本試驗考察了D101、AB-8、DA201-C、HPD-400、HPD-826五種大孔樹脂對蠶蛹ACE抑制肽的吸附洗脫效果,發(fā)現(xiàn)DA201.C的吸附率、解析率都是最大的,其吸附率為45.79%,解析率為66.43%。因此,選擇DA201.C繼續(xù)下面的試驗。
　　 考察了樣品上樣

7、濃度、上樣流速和乙醇洗脫劑濃度對蠶蛹ACE抑制肽分離純化效果,最后得出上樣濃度為50mg/mL,上樣流速為0.5mL/min,乙醇洗脫劑的濃度為75%時分離純化效果最好。當乙醇濃度為75%時,洗脫液(記為a)具有最高的疏水值為5.98kJ/mol,最高的芳香族氨基酸含量11.13%,最高的ACE抑制率57.79%。疏水性值、芳香族氨基酸含量與ACE抑制率呈正相關(guān)。在此條件下得到的解析液(記為a)的Icso=0.632mg.mL-1,曲線

8、方程為:y=-21.74174x2+76.79228x+10.1188(R2=0.999)。
　　 (4)蠶蛹ACE抑制肽的SephadexG-25純化
　　 將得到的解析液(a),再經(jīng)過SephadexG-25純化,出現(xiàn)3個峰,其ACE抑制率分別為:a-P1為24.82%,a-P2為34.37%,a-P3為52.64%(多肽濃度為0.2mg/mL),因此選擇a-P3進行下一步試驗。
　　 (5)蠶蛹ACE抑制肽

9、的半制備RP-HPLC純化及其結(jié)構(gòu)鑒定
　　 將a-P3進行半制備RP-HPLC分析,發(fā)現(xiàn)其分為10個峰,其中a-P3-6的ACE抑制率最高為52.07%(多肽濃度為0.05mg/mL)。再將a.P3-6進行液相色譜分析,其分為2個峰,其中a-P3-6-b的ACE抑制率稍高為54.27%(多肽濃度為0.05mg/mL)。
　　 將a-P3-6-b進行氨基酸序列分析,最后得出其序列為Val-Glu-Ile-Ser(纈氨酸-

10、谷氨酸-異亮氨酸-絲氨酸)。
　　 (6)蠶蛹ACE抑制肽的理化性質(zhì)研究
　　 蠶蛹ACE抑制肽(組分a-P3)在pH2-10范圍內(nèi)的溶解度均大于80%。蠶蛹ACE抑制肽(組分a-P3)經(jīng)消化酶水解后活性變化不大,經(jīng)胃酶和胰酶作用后,其ACE抑制率(0.8mg/mL)降低了1.90%。當溫度在20-50℃時,溫度對ACE抑制率的影響較小。蠶蛹ACE抑制肽(組分a-P3)在中性和偏酸性的條件下比較穩(wěn)定。當NaCl濃度大于0