家蠶過剩半月紋退化腹肢突變(Edl)的精細定位及相關調(diào)控元件鑒定.pdf

1、昆蟲為了生存和繁衍演化出多樣性的附肢，從發(fā)育生物學角度來看主要是進化過程中基因差異表達和功能變化的結(jié)果。附肢的發(fā)育是一個復雜的生理過程，由多層次的基因網(wǎng)絡級聯(lián)調(diào)控形成。同源異型基因（Homeotic gene,Hox）是首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，是昆蟲軀體模式發(fā)育的主要調(diào)控基因；Hox基因在基因組上成簇排列，按其在基因組上排列的順序從3’到5’依次表達，分別決定軀體從前到后不同體節(jié)的特征，特別是附肢發(fā)育部位和形態(tài)等特征，對研究附肢發(fā)育和分化有

2、重要的意義。在昆蟲中對Hox基因功能的研究已經(jīng)有一定基礎，研究發(fā)現(xiàn)由于不同物種中Hox基因功能在進化上差異分化生成各式各樣的附肢。Hox基因的表達受到精確的調(diào)控，在果蠅BX-C基因簇中已鑒定分析發(fā)現(xiàn)大量的順式調(diào)控元件和非編碼RNA（Non-coding RNA,ncRNA）調(diào)控Hox基因的精確表達；而在其他昆蟲中Hox基因的表達調(diào)控研究，特別是Hox基因簇中功能元件對Hox基因調(diào)控的研究仍然匱乏。
　　家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲，擁有完

3、整的基因組數(shù)據(jù)和精細的遺傳變異圖譜，也是鱗翅目基礎生物學研究的重要模式。家蠶保存有大量Hox基因座位的突變，如E擬復等位基因群（E群），是研究鱗翅目Hox基因功能和表達調(diào)控的良好材料。家蠶E群位點有3個Hox基因，涉及30多個突變體，本研究選取E群過剩半月紋退化腹肢突變（extra-crescents and degenerated abdominal legs mutant,Edl）作為研究材料，通過定位克隆、表達分析及免疫組化等手段

4、探究Hox基因?qū)dl突變形成的作用機制；并且利用生物信息學、表達關聯(lián)分析及RNAi等方法對定位區(qū)間存在的功能元件進行鑒定和功能研究，分析功能元件與Hox基因之間可能的作用關系。本論文所得主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶Edl突變的形態(tài)特征觀察和遺傳分析
　　家蠶Edl突變位于家蠶第6連鎖群21.1位點，是E群突變之一，其經(jīng)典表型特征描述為：幼蟲第3腹節(jié)背面有過剩半月紋，無星紋，第1腹足退化，顯性突變。觀察其表型特征為：幼蟲第3

5、腹節(jié)背面有一對過剩半月紋，第5腹節(jié)有星紋，同時腹面的第一對腹足退化，腹足遠端的爪鉤缺失，此外個別個體背部2、3腹節(jié)半月紋處出現(xiàn)環(huán)節(jié)愈合現(xiàn)象。遺傳分析顯示大造（正常型）與Edl雜交得F1為正常型，F(xiàn)1自交產(chǎn)生的F2會分離出正常型和Edl突變表型，且分離比為3:1；F1個體與正常型正反測交得到的后代均為正常型，F(xiàn)1個體與Edl正反測交，得到的后代Edl突變性狀和正常型分離比1:1。通過雜交和回交實驗發(fā)現(xiàn)Edl突變?yōu)殡[性突變，利用家蠶雌完全連

6、鎖的特性，對大造和Edl突變進行雜交，再和Edl突變測交，配制連鎖定位群體。根據(jù)家蠶E群ECs-l和EKp-1突變的定位區(qū)域直接設計marker，利用386個BC1M個體對Edl突變進行定位，Edl突變位點被定位在marker SD02和SD04之間，與marker SD03緊密連鎖，區(qū)間包含Bmabd-A。我們發(fā)現(xiàn)Edl突變是E群變中目前發(fā)現(xiàn)的唯一隱性突變。
　　2.Edl突變的精細定位和分子解析
　　擴大群體到1205個

7、BC1M個體并加密標記，對Edl突變進行精細定位。Edl突變位點被定位到marker D4和D6之間約211 Kb的區(qū)域，此區(qū)域為Hox基因Bmabd-A和Bmabd-B之間的一段無預測基因的間區(qū)，分別位于Bmabd-A上游，Bmabd-B下游，距Bmabd-A約10Kb，Bmabd-B約100Kb。Edl突變第三腹節(jié)腹足退化，在該環(huán)節(jié)主要表達的是Bmabd-A基因，且是家蠶腹足發(fā)育的必須基因，因此我們在家蠶胚胎腹足發(fā)育的關鍵時期戊3期

8、（胚胎發(fā)育第20個階段）調(diào)查Bmabd-A的表達，結(jié)果表明在該時期對腹足發(fā)育有重要作用的Bmabd-A表達水平降低。Hox基因簇中相鄰基因間能相互調(diào)控，且基因組上排列靠后的Hox基因能抑制靠前基因的表達。我們調(diào)查Bmabd-A鄰近Hox基因的表達發(fā)現(xiàn)，在基因組上分別位于Bmabd-A前后的BmUbx和Bmabd-B表達都明顯升高。同時我們通過免疫熒光技術，調(diào)查了腹足遠端發(fā)育基因BmDll的表達情況，在大造和Edl突變正常發(fā)育附肢原基頂端

9、都能檢測到BmDll的表達，而在Edl突變退化的腹足原基處BmDll的表達缺失，這與Edl突變?nèi)笔Ц棺氵h端的表型相符。我們推測在Edl突變中Bmabd-A的表達降低，繼而改變腹足遠端基因BmDll的表達，使突變中出現(xiàn)退化腹足的表型。
　　3.Edl突變定位區(qū)間miRNA和順式調(diào)控元件分析
　　家蠶E位點與果蠅BX-C區(qū)域的序列同源，在果蠅同源的區(qū)域中有大量的順式調(diào)控元件和miRNA對鄰近的Hox基因有調(diào)控作用。本部分我們分析

10、了Edl定位區(qū)間miRNA胚胎期的表達模式及其與Hox基因表達的相關性；預測和鑒定Edl定位區(qū)間的CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，并對其在家蠶中保守性和在Edl突變及多品系中差異性進行分析。Edl定位區(qū)間中有miR-iab-4和miR-2835兩個miRNA位點，其中miR-iab-4位點能形成miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p和miR-iab-8三個miRNA。首先通過克隆分析發(fā)現(xiàn)兩個miRNA基因組上的pre-miRNA序

11、列在Edl和野生型中沒有任何差異。然后我們利用不同的軟件預測miRNA在BmUbx和Bmabd-A mRNA序列上的靶位點。RNAhybrid軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-3p在BmUbx和Bmabd-A序列上分別有4和5個靶位點；miR-iab-4-5p在BmUbx序列上有4個靶位點而在Bmabd-A序列上沒有靶位點；miR-iab-8在BmUbx和Bmabd-A序列上都只有1個靶位點；miR-2835在BmUbx和Bmabd-A序

12、列上分別有4和1個靶位點。利用miRnada軟件預測發(fā)現(xiàn)所有的miRNA在BmUbx上都沒有作用位點，而miR-iab-4-3p，miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A上分別有1，2，1個靶位點。利用PITA軟件預測發(fā)現(xiàn)只有miR-iab-8在BmUbx上有1個靶位點，其他miRNA在BmUbx上沒有靶位點；miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p，miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A上分別有2，

13、1，4，3個靶位點。值得注意的是，miRnada和PITA軟件預測的miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A序列上有部分重疊的靶位點，而沒有發(fā)現(xiàn)有三個軟件共同預測的靶位點。由于家蠶腹足在胚胎期就已經(jīng)形成，我們對miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p，miR-2835，BmUbx和Bmabd-A在大造胚胎期的表達模式進行檢測，并計算這三個miRNA和BmUbx，Bmabd-A表達之間的相關性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmUbx和B

14、mabd-A的表達與這三個miRNA的表達沒有相關性。
　　CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點是Hox基因簇中重要的順式調(diào)控元件，對Hox基因的精確時空表達有重要調(diào)節(jié)作用。對Edl突變定位區(qū)間的CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)共有8個CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。瓊脂糖凝膠檢測發(fā)現(xiàn)只有2位點的序列有多態(tài)性，多品系分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)性并不特異。對結(jié)合位點及其前后各50bp的序列在家蠶和野蠶多品系中進行保守性分析，發(fā)現(xiàn)2、6、7、8位點序列保守

15、，其他位點不保守。對Edl定位區(qū)間CTCF結(jié)合位點序列比對分析發(fā)現(xiàn)，在Edl突變中只有1和3位點與Dazao有差異，且多品系比對發(fā)現(xiàn)是非Edl品系特異性差異。多品系分析發(fā)現(xiàn)2、6、7、8位點最保守，在所有的品系中都沒有差異；1、5位點序列中有少量非品系特異差異；3、4位點有品系特異的差異。對定位區(qū)間不保守的1、3、4、5位點的變異序列進行分析，發(fā)現(xiàn)只有4位點第13個位置的序列由G變?yōu)锳會導致4位點失去活性，其他變異并不影響位點的CTCF

16、蛋白結(jié)合活性；4位點和5位點在鄰近基因組位點，且4位點和5位點序列在檢測的品系中不同時發(fā)生變異，保持該基因組區(qū)域CTCF蛋白結(jié)合調(diào)控的能力。綜上Edl突變定位區(qū)間除了結(jié)合位點4的所有CTCF結(jié)合位點與CTCF蛋白結(jié)合能力都是保守的，所有結(jié)合位點所在的基因組位點與CTCF蛋白結(jié)合能力均保守。
　　4.Edl突變定位區(qū)間lncRNA分析
　　我們在Bmabd-A和Bmabd-B基因間區(qū)發(fā)現(xiàn)一個新轉(zhuǎn)錄本，通過Race技術獲得全長，

17、ORF預測和分析發(fā)現(xiàn)其ORF小于300個堿基且無保守的結(jié)構(gòu)域，鑒定為一個長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA），并命名為lncRNA-iab1。lncRNA-iab1具有多種剪接體，根據(jù)剪接體3’端在基因組上不同的位置可以分為兩類type1和type2。利用LncTar軟件預測lncRNA-iab1與BmUbx、Bmabd-A和Bmabd-B可能的相互作用，發(fā)現(xiàn)lncRNA-iab1的各類剪接體都不能直

18、接與BmUbx、Bmabd-A和Bmabd-B相互作用。利用RNAhybrid、miRnada和PITA三個不同的軟件對miRNA在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本上的作用位點進行預測，miRnada軟件預測發(fā)現(xiàn)只有miR-iab-4-5p和miR-iab-4-3p在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本type2剪接體上分別有1個作用位點；RNAhybrid軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-5p、miR-iab-4-3p和miR-2835在lncRN

19、A-iab1轉(zhuǎn)錄本上分別有1、1、2個作用位點，miR-iab-8在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本上沒有作用位點，且除了miR-2835有一個位點只在type2剪接體存在，其他所有位點在各類剪接體都存在；PITA軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-3p和miR-iab-8在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本type2剪接體上分別有2個作用位點。綜上我們發(fā)現(xiàn)miRNA與lncRNA-iab1可能有相互作用。
　　通過胚胎期表達譜分析發(fā)現(xiàn)lncR

20、NA-iab1與其內(nèi)含子區(qū)域的3個miRNA基因miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p和miR-2835的表達沒有相關性；lncRNA-iab1與Bmabd-A和Bmabd-B的表達模式在胚胎期和幼蟲期存在很強的相關性，在變態(tài)發(fā)育期它們表達模式之間的相關性降低；lncRNA-iab1與 BmUbx的表達模式只在胚胎期有很強的相關性。4齡將眠組織表達分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-iab1在神經(jīng)和表皮中有特異性高表達，其中表皮中表達最

21、高；對表皮進行分段檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA-iab1沿體軸從前往后表達量逐漸升高，第7-10腹節(jié)表達最高。為了探討lncRNA-iab1的功能，在4齡2天對lncRNA-iab1進行RNAi處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干涉?zhèn)€體大量致死（死亡個體和總注射個體的比例13/14，12/12），而干涉對照個體基本無影響（死亡個體和總注射個體的比例1/12），進一步通過分子檢測發(fā)現(xiàn)lncRNA-iab1干涉?zhèn)€體中l(wèi)ncRNA-iab1的表達顯著降低。調(diào)查干涉組中

22、相關Hox基因Bmabd-A和Bmabd-B的表達，結(jié)果顯示并無顯著性變化。我們推測lncRNA-iab1與 Hox基因的表達相關性可能與lncRNA-iab1的生產(chǎn)過程相關，即其成熟的轉(zhuǎn)錄本不影響Hox基因的表達水平；其轉(zhuǎn)錄本可能參與其他生理上的功能，對家蠶的存活有重要的影響。
　　在Edl突變中只檢測到lncRNA-iab1的type2類剪接體，type2部分剪接體的3’末端與Dazao比有差異，且缺少了type2類剪接體中與

23、Bmabd-A重疊的剪切形式。在Dazao和Edl突變腹足發(fā)育關鍵時期（戊3期）lncRNA-iab1的總轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異；而Edl突變中l(wèi)ncRNA-iab1只有type2類剪接體，比較Dazao和Edl突變中type2類剪接體表達水平，即Dazao中type2類剪接體和Edl突變中總轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，Edl突變中type2類剪接體轉(zhuǎn)錄水平顯著比Dazao中要高。lncRNA-iab1中type2類剪接體轉(zhuǎn)錄覆蓋的基因組區(qū)域遠遠大于typ