家蠶翻譯調(diào)控腫瘤蛋白的組織定位和表達(dá)研究.pdf

1、翻譯調(diào)控腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)是一種廣泛存在于各種真核生物中的蛋白，它具有鈣離子及微管蛋白結(jié)合能力，能促進(jìn)免疫細(xì)胞釋放組胺等物質(zhì)而引起炎癥反應(yīng)，其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個層面上受到多種因素的調(diào)控。大量研究表明，TCTP作為一種持家蛋白，參與很多細(xì)胞生理過程，包括細(xì)胞生長、細(xì)胞周期的進(jìn)行、惡性遷移、抗逆、抗凋亡，并且表現(xiàn)胞外細(xì)胞因子活性。 在對家蠶蛹cDN

2、A文庫測序中，發(fā)現(xiàn)一個編碼家蠶TCTP的cDNA序列。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA序列全長為770 bp，含有一個長519 bp的開放閱讀框(ORF)，其編碼的蛋白質(zhì)為家蠶翻譯調(diào)控腫瘤蛋白(Bombvx mori translationally controlled tumorprotein，BmTCTP)，全長172個氨基酸殘基，預(yù)測相對分子質(zhì)量為19.8 kDa，等電點為4.54。 PCR擴增得.BmTCTP完整ORF，經(jīng)

3、BamHI和Xho I雙酶切后，插入質(zhì)粒pET-28a(+)的相應(yīng)酶切位點，構(gòu)建重組融合蛋白表達(dá)載體pET-28a(+)-BmTCTP，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞，篩選得重組菌株后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，裂解菌作SDS-PAGE分析，在30 kD處有一濃集的特異性蛋白條帶，表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的50﹪左右。融合蛋白以可溶形式存在，超聲波裂解菌體后離心收集上清液，采

4、用鎳離子親和層析柱純化重組融合蛋白rBmTCTP。以該融合蛋白為抗原免疫雄性新西蘭兔制作了多克隆抗體，ELISA檢測該抗體血清的效價可達(dá)到1：16000左右。對蠶蛹總蛋白作免疫印記實驗，在25kDa處有特異陽性條帶，可能是蛋白本身呈酸性或存在修飾的緣故。隨后以多克隆抗體為工具，對BmTCTP進(jìn)行亞細(xì)胞定位、蠶蛹發(fā)育不同時期表達(dá)情況分析、蠶蛹組織定位實驗，發(fā)現(xiàn)BmTCTP存在于家蠶BmN細(xì)胞的胞質(zhì)中，在蠶蛹發(fā)育各個時期都有，且在末期表達(dá)量