MEN1基因參與調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳蛋白的合成.pdf

1、改善奶牛的泌乳性能，提高奶牛的泌乳產(chǎn)量，一直以來都是奶牛遺傳育種工作者的目標(biāo)。有研究表明，MEN1基因可以通過影響垂體的功能、抑制催乳素啟動(dòng)子活性、催化ERα激活等方面，而對(duì)乳腺發(fā)育和性能的改善發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。MEN1(multiple endocrine neoplasia type1)基因，是多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1型綜合征的關(guān)鍵致病基因，其表達(dá)的蛋白menin不僅可以與大量關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用，通過表觀遺傳方式調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄和細(xì)

2、胞表型，也可與大量的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路因子相互作用，廣泛參與機(jī)體正常發(fā)育和代謝的平衡穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。本研究擬以MEN1基因作為奶牛泌乳重要候選基因，研究其在奶牛乳腺泌乳過程，尤其是在乳蛋白合成過程中的調(diào)控作用。PI3K/Akt/mTOR和JAK2-STAT5信號(hào)通路作為乳腺中調(diào)節(jié)乳蛋白合成的重要信號(hào)途徑，研究MEN1基因?qū)ζ湫盘?hào)通路內(nèi)因子的調(diào)控作用對(duì)于研究該基因?qū)θ榈鞍缀铣傻恼{(diào)控具有重要意義。
　　因此，本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T

3、為模型，構(gòu)建及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-C2-bMEN1，進(jìn)行MEN1基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)；應(yīng)用RNAi的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，進(jìn)行MEN1基因表達(dá)抑制實(shí)驗(yàn)。后采用qRT-PCR、Western blot技術(shù)，在mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)與乳蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路基因的表達(dá)變化，在mRNA水平檢測(cè)主要酪蛋白之一κ-酪蛋白基因CSNK的表達(dá)變化；同時(shí)，選取干奶期及泌乳峰期的奶牛乳腺組織，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同泌乳時(shí)期乳腺組織內(nèi)MEN1基因及乳

4、蛋白合成相關(guān)信號(hào)通路基因在mRNA水平的表達(dá)關(guān)系。通過體外試驗(yàn)和體內(nèi)驗(yàn)證的聯(lián)合，尋求MEN1基因的表達(dá)對(duì)奶牛乳腺內(nèi)乳蛋白合成的調(diào)控關(guān)系，從而為奶牛乳腺泌乳調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為遺傳改良奶牛乳品質(zhì)和乳產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果表明：
　?、贅?gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-C2-bMEN1在MAC-T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，并在轉(zhuǎn)染24h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEN1基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)量均極顯著提高（P＜0.01）；

5、>　?、趒RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MEN1基因的過表達(dá)可在mRNA水平顯著降低包括Akt、mTOR、S6K1、4E-BP1及STAT5在內(nèi)的與乳蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)（P＜0.01）；Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MEN1基因過表達(dá)也同時(shí)有下調(diào)包括Akt、mTOR、S6K1在內(nèi)的蛋白表達(dá)（P＞0.05）的趨勢(shì)；而MEN1基因低表達(dá)則表現(xiàn)出相反的調(diào)節(jié)作用。
　?、墼贛EN1基因過表達(dá)條件下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，作為主要酪蛋白亞型之一的κ-酪蛋白

6、基因CSNK在mRNA水平表達(dá)顯著降低（P＜0.05），而MEN1基因的低表達(dá)則能顯著上調(diào)CSNK基因在mRNA水平的表達(dá)（P＜0.01）。
　?、茉隗w內(nèi)奶牛乳腺組織的研究結(jié)果顯示，泌乳高峰期乳腺組織內(nèi)MEN1基因的表達(dá)量低于干奶期乳腺組織內(nèi)的表達(dá)；而與干奶期相比，泌乳高峰期的乳腺組織在mRNA水平不僅存在較高水平的酪蛋白基因表達(dá)，包括CSNB（P＞0.05）、CSNAS1、CSNAS2、CSNK（P＜0.05），同時(shí)也有更高水平