血液制品人細(xì)小病毒B19污染情況調(diào)查及新型病毒滅活方法研究.pdf

1、人細(xì)小病毒B19(human parvovirus B19,簡(jiǎn)稱B19)，是已知唯一對(duì)人類致病的細(xì)小病毒，病毒無(wú)包膜、耐熱，直徑小(18～20 nm)，基因組為線性單鏈DNA分子，約5.5kb。B19病毒有普遍易感性，可通過(guò)呼吸道傳播,晚冬和早春是感染高峰，幾乎成世界范圍分布。又因其具有直徑小和耐熱的特性，對(duì)現(xiàn)有的血液制品生產(chǎn)工藝中采用的病毒滅活和去除方法具有較高抵抗力，現(xiàn)有生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的血液制品存在一定的B19病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。因此，加強(qiáng)

2、原料血漿篩查以降低生產(chǎn)用原料血漿病毒含量是確保制品安全性的重要手段之一。PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、能準(zhǔn)確定量等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究課題的第一部分內(nèi)容是，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)國(guó)內(nèi)原料血漿及血制品病毒的污染情況進(jìn)行了調(diào)查分析，以期為血液制品生產(chǎn)工藝改進(jìn)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。其中2276份獻(xiàn)漿員血漿樣本，9份初篩陽(yáng)性，對(duì)初篩陽(yáng)性樣本復(fù)測(cè)3次，確認(rèn)陽(yáng)性4份。對(duì)血液制品成品進(jìn)行檢測(cè)，靜注人免疫球蛋白樣本84批，均為陰性

3、；人纖維蛋白原樣本14批，1批確認(rèn)陽(yáng)性；人凝血因子Ⅷ樣本25批，9批確認(rèn)陽(yáng)性；人凝血酶原復(fù)合物樣品24批，18批確認(rèn)陽(yáng)性。本研究陽(yáng)性結(jié)果與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果較為一致，為今后進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。
　　傳統(tǒng)血液制品病毒滅活工藝如加熱法、S/D、低pH法對(duì)脂包膜病毒滅活效果較好，對(duì)非脂包膜病毒滅活效果較差或無(wú)效。近年來(lái)，針對(duì)非脂包膜病毒的滅活方法也不斷涌現(xiàn)，如納米膜過(guò)濾法，熱滅活法等，但這些方法對(duì)人細(xì)小病毒B19效果欠佳。本研究課題

4、的第二部分內(nèi)容是，建立一種全新的短波紫外線病毒滅活方法，采用UVC滅活儀UVivatec（為德國(guó)拜耳與賽多利斯聯(lián)合開(kāi)發(fā)研制）對(duì)血液制品中的模擬病毒—豬細(xì)小病毒（PPV）進(jìn)行滅活驗(yàn)證。設(shè)定紫外輻射劑量分別為200、250和300J/m2，用微量細(xì)胞病變法檢測(cè)殘余病毒滴度，對(duì)滅活效果加以驗(yàn)證，獲得滿意效果。短波紫外UVC法可使PPV病毒滴度降低4log以上，符合病毒滅活驗(yàn)證指南的要求。
　　本研究課題第三部分內(nèi)容是，短波紫外UVC病毒

5、滅活方法對(duì)人凝血酶原復(fù)合物產(chǎn)品質(zhì)量的影響研究。通過(guò)對(duì)UVC滅活處理前后的樣品進(jìn)行活性測(cè)定和比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有添加任何保護(hù)劑的情況下，凝血因子活性回收率大于70％。為排除蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，我們同時(shí)運(yùn)用二維電泳（2-DE）、高效液相色譜技術(shù)（HPLC）平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。HPLC分析結(jié)果證實(shí)，UVC照射后，蛋白聚合體含量無(wú)明顯改變，與照射前比較，蛋白的色譜行為基本一致；2-DE檢測(cè)顯示，樣品滅活處理后，圖譜蛋白斑點(diǎn)數(shù)量基本相等，蛋白

6、點(diǎn)大小及位置基本一致。
　　人細(xì)小病毒 B19具有普遍易感性，對(duì)免疫力較低的患者具有潛在的致病威脅，獻(xiàn)漿員含病毒的單個(gè)單位血漿有使整個(gè)血漿池污染的潛在危險(xiǎn)，短波紫外UVC對(duì)無(wú)胞膜病毒滅活效果較好。為排除短波紫外UVC照射使蛋白質(zhì)形成聚合體或裂解成小的蛋白碎片，進(jìn)而引起其活性功能的改變的影響，我們用活性檢測(cè)方法和2-D及SEC-HPLC對(duì)滅活處理后樣品中蛋白質(zhì)功能與結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，使各種檢測(cè)方法互為補(bǔ)充，獲得了較滿意的結(jié)果。樣品在U