R10，新型p38 MAPK抑制劑生物學功能研究.pdf

1、p38 MAPK最初作為巨噬細胞中一種受脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激的酪氨酸磷酸化蛋白而被鑒定出來，目前有p38α、p38β、p38δ和p38γ四種亞型。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)介導信號通路的重要分支，參與到炎癥、增殖、凋亡等多種生理過程。其中以在炎癥方面作用最為突出:促炎因子、趨化因子、降解酶類、生長因子、粘附分子

2、以及其它炎癥因子的產(chǎn)生都依賴p38通路的調(diào)節(jié)。炎癥反應失控可能導致動脈硬化、癌癥等一系列嚴重疾病的發(fā)生。傳統(tǒng)抗炎藥物雖然能夠緩解炎癥狀況，但是顯著的副作用讓人們不得不尋找更好的抗炎藥物。目前，以阻斷炎癥反應相關的信號通路為導向的研發(fā)策略已經(jīng)成為抗炎藥物研發(fā)的主流趨勢。由于p38MAPK通路在炎癥反應中占有重要地位，所以如何在信號通路水平阻斷和調(diào)控p38 MAPK的表達和活性以治療相關疾病已經(jīng)成為近年來信號轉(zhuǎn)導領域的研究熱點之一。迄今為止

3、，已經(jīng)有100多種p38抑制劑被報道，但是沒有一種能夠真正應用的臨床治療當中。大都止步于臨床試驗階段的安全性檢驗過程。尋找一種安全、高效的p38抑制劑已經(jīng)迫在眉睫。
　　利用生物信息學手段對現(xiàn)有的數(shù)據(jù)進行分析、挖掘，從而有效的為生物實驗科學提供預測，已經(jīng)成為生命科學研究的趨勢。本課題正是基于此結(jié)合實驗室前期生物信息學對p38 MAPK家族進行的能量統(tǒng)計偶聯(lián)分析預測得到的一段可能對p38 MAPK有抑制性作用的多肽序列的基礎上通過對

4、其生物學功能的研究達到尋找新型p38MAPK抑制劑的目的。與此同時對尋找蛋白激酶信號通路抑制劑的新研究模式進行初步探索。
　　1、首先，我們在體外合成了R10多肽，利用體外激酶反應實驗技術對其生物學功能進行了初步研究。我們分別研究了R10多肽對于p38 MAPK上游激酶MKK6對p38磷酸化、p38自身磷酸化和p38對其下游底物ATF-2的磷酸化三個水平的影響。觀察實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)R10能夠明顯的抑制p38磷酸化其下游底物的過程，并且

5、抑制作用隨著濃度的增加而增強。但是，當R10多肽的濃度達到一定濃度后，抑制作用趨于穩(wěn)定，即使提高R10的濃度也不會造成徹底的抑制。另外，R10多肽對于其他兩個水平的磷酸化沒有明顯的抑制作用。
　　2、在體外生物學功能得到驗證后，我們又進一步在細胞學水平對R10多肽的生物學功能進行了進一步的研究。分別從p38 MAPK經(jīng)典的級聯(lián)反應通路和p38自身磷酸化的輔助通路進行了研究。因為我們的研究是為炎癥治療藥物做篩選物，我們放棄了傳統(tǒng)的細

6、胞轉(zhuǎn)染方法，而采用了直接讓R10多肽進入細胞的方法。為了能夠?qū)10多肽順利的“運輸”到細胞內(nèi)部并且發(fā)揮作用，我們采取了細胞穿透肽技術中經(jīng)典的TAT標簽作為轉(zhuǎn)運工具。并添加了綠色熒光蛋白EGFP作為示蹤因子構(gòu)建了His-TAT-EGFP-R10融合蛋白。結(jié)果表明我們成功的將R10多肽轉(zhuǎn)導進入NIH/3T3細胞內(nèi)部，并且沒有影響其生物學功能。通過檢測p38 MAPK通路的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，His-TAT-EGFP-R10融合蛋白能夠有效的抑

7、制p38磷酸化ATF-2的過程，但是不會對p38 MAPK通路其他水平的磷酸化造成影響。并且證實了在His-TAT-EGFP-R10融合蛋白中是R10基團發(fā)揮的抑制作用。
　　3、炎癥因子的釋放是炎癥反應擴大的重要環(huán)節(jié)之一，如果能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控炎癥因子的表達水平就能夠有效的調(diào)控炎癥反應。因此，我們選擇了在受p38 MAPK通路調(diào)控的在炎癥反應中具有重要地位的細胞因子——IL-8作為檢測指標。在檢測技術上我們沒有選擇傳統(tǒng)的ELIS

8、A方法，而是選擇了節(jié)約樣本、高通量、高靈敏度的基于Luminex技術的液相蛋白芯片系統(tǒng)LiquiChip進行檢測。觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，His-TAT-EGFP-R10融合蛋白在500 nmol/L時開始對IL-8的表達產(chǎn)生明顯的抑制作用，當濃度提高至1，000 nmol/L時，抑制作用進一步增強。通過進一步的實驗證明，在His-TAT-EGFP-R10融合蛋白中是R10基團對IL-8的表達發(fā)揮了抑制作用。
　　4、XTT實驗表明，His