p38MAPK抑制劑FR167653對(duì)肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、背景:肝臟的缺血再灌注損傷（Ischemia/Reperfusion Injury，IRI）是肝臟外科常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。在休克的復(fù)蘇、嚴(yán)重的肝臟外傷、肝門(mén)阻斷的肝葉切除以及肝臟移植等過(guò)程中肝臟均不可避免的遭受IRI，而IRI造成的組織損傷是影響上述疾病治療效果的重要原因之一。肝臟IRI發(fā)生的確切機(jī)制目前仍不明確，研究表明腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1（IL-1）等多種細(xì)胞因子參與上述過(guò)程。多個(gè)研究證實(shí)絲裂原激活的蛋白酶（M

2、itogen Activated Potein Kinase，MAPKs）是TNF-α、IL-1等細(xì)胞因子表達(dá)的重要調(diào)控因子，并在IRI中起重要作用。新型合成藥物FR167653可以特異性抑制p38MAPK活性，從而阻斷下游事件發(fā)生，抑制TNF-α和IL-1等細(xì)胞因子的表達(dá)。其在肝臟IRI中的確。 目的:為了初步探討p38MAPK特異性活性抑制劑FR167653在大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用。 方法:本研究利用封閉群S

3、D大鼠缺血再灌注模型后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分假手術(shù)組（大鼠只接受麻醉、開(kāi)腹及局部游離，肝臟未經(jīng)受任何的冷熱缺血和再灌注損傷），對(duì)照組（建立的缺血再灌注模型大鼠），治療組（缺血再灌注模型大鼠在肝臟缺血前30min經(jīng)門(mén)靜脈注入FR167653）。分別在1h、3h、6h、24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死6只大鼠，按照相應(yīng)程序采集標(biāo)本行血清肝功能檢測(cè)、病理學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)、外周血細(xì)胞因子濃度檢測(cè)、肝組織髓過(guò)氧化酶（MPO）活性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以x+s表示，統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)處理用spss12．0軟件完成。組間均數(shù)差異作One-way ANOVA分析，P<0．05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1．再灌注后1h、3h、6h、24h各時(shí)點(diǎn)大鼠外周血肝功能酶學(xué)指標(biāo)水平均明顯升高，術(shù)后6h達(dá)到高峰，24h后有減緩。治療組再灌注后各個(gè)時(shí)點(diǎn)的ALT、AST水平明顯低于對(duì)照組，在再灌注后3h，6h，24h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間差異有顯著性意義（P<0．05）。 2．病理學(xué)結(jié)果顯示：再灌注后3h，對(duì)照組肝

5、細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞內(nèi)空泡樣變性數(shù)量增多，并可見(jiàn)散在壞死細(xì)胞，肝竇間隙輕度增寬；治療組肝細(xì)胞腫脹程度較對(duì)照組改善，細(xì)胞內(nèi)僅見(jiàn)少量空泡樣變性，未見(jiàn)明顯的壞死細(xì)胞，肝竇間隙增寬不明顯；治療組肝臟結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯改善。再灌注后6h，對(duì)照組肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，肝細(xì)胞邊界不清，有較多的壞死細(xì)胞，并可見(jiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部可見(jiàn)明顯的肝葉結(jié)構(gòu)損害；治療組肝細(xì)胞僅見(jiàn)腫脹及少量空泡樣變性，僅見(jiàn)少量零星的壞死細(xì)胞，周?chē)猩倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)。再灌注24h，對(duì)照組

6、肝細(xì)胞腫脹減輕，但局部可見(jiàn)壞死灶，壞死肝細(xì)胞形態(tài)不可辨別，細(xì)胞崩解、壞死，細(xì)胞核分解；治療組肝細(xì)胞腫脹減輕。 3．免疫組織化學(xué)檢測(cè)：1）P-selectin：對(duì)照組缺血再灌注后3h，肝內(nèi)小血管及部分肝細(xì)胞上可見(jiàn)明顯的P-selectin的表達(dá)；治療組再灌注后3h時(shí)點(diǎn)的P-selectin表達(dá)明顯受抑制，部分視野可見(jiàn)肝竇內(nèi)皮有零星表達(dá)，在多個(gè)隨機(jī)視野未見(jiàn)到肝細(xì)胞上有明顯的表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率低于對(duì)照組。2）ICAM-1：對(duì)照組在缺血再

7、灌注后的3h可以見(jiàn)到明顯的ICAM-1表達(dá)，主要表達(dá)在細(xì)胞間基質(zhì)，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上。治療組再灌注后3h時(shí)ICAM-1表達(dá)明顯受抑制，在多個(gè)隨機(jī)視野中未見(jiàn)到明顯的ICAM-1表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組。 4．ELISA檢測(cè)：1）TNF-α：假手術(shù)組肝臟組織中TNF-α的表達(dá)較低；缺血再灌注后1h、3h、6h，對(duì)照組肝臟組織中TNF-α的表達(dá)明顯增高，尤其是再灌注后3h表達(dá)出現(xiàn)明顯的高峰；治療組TNF-α的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，尤其

8、是再灌注后3h表達(dá)未出現(xiàn)高峰。再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間TNF-α的表達(dá)量差異均有顯著性意義。2）IL-1β：假手術(shù)組肝臟組織中IL-1β的表達(dá)較低；缺血再灌注后1h、3h、6h，對(duì)照組肝臟組織中IL-1β的表達(dá)明顯增高，尤其是再灌注后3h出現(xiàn)明顯的高峰；治療組IL-1β的表達(dá)明顯降低，被抑制在明顯低于對(duì)照組的水平，尤其是再灌注后3h未出現(xiàn)明顯的高峰。再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組間IL-1β的表達(dá)均有明顯的差異（P<0．05）。 5．肝

9、臟組織MPO活力檢測(cè)：各組再灌注后1h、3h、6h肝臟組織中MPO活力逐漸增高；1h、3h、6h、24h時(shí)點(diǎn)，治療組肝臟組織中MPO活力總體水平均低于對(duì)照組相應(yīng)各點(diǎn)，存在顯著性差異（P<0．05）。 6．RT-PCR方法檢測(cè)肝臟組織iNOS mRNA：假手術(shù)組肝臟組織未檢測(cè)到iNOS mRNA表達(dá)；在對(duì)照組，再灌注后1h即表達(dá)明顯的iNOS mRNA，并隨著時(shí)間的推移，iNOS mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在再灌注后6h出現(xiàn)表達(dá)高峰。

10、再灌注后24h iNOS mRNA表達(dá)逐漸下降。在治療組，iNOS mRNA表達(dá)明顯受到抑制，再灌注后6h并未出現(xiàn)明顯的高峰。 結(jié)論:研究表明FR167653能在多個(gè)環(huán)節(jié)多個(gè)層次對(duì)缺血再灌注肝臟起著保護(hù)作用： （1）抑制p38MAPK活性，從而抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)，中斷或削弱細(xì)胞因子的“瀑布樣”反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)造成的組織損傷。 （2）降低細(xì)胞黏附分子ICAM-1及選擇素家族分子的表達(dá)，抑制中性粒細(xì)胞