電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠p38MAPK信號(hào)通路的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　利用電針的低創(chuàng)傷、易操作和可控性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合針灸經(jīng)典理論“心胸內(nèi)關(guān)謀”，并借助已有的關(guān)于內(nèi)關(guān)-心臟相關(guān)性的研究基礎(chǔ)，觀察電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注大鼠早期心功能參數(shù)、心室重構(gòu)、心肌梗死情況，血清及心肌相關(guān)因子、線粒體呼吸功能的影響，并借用p38MAPK通路阻滯劑SB203580從p38MAPK信號(hào)通路的角度分析其作用機(jī)制，為臨床各型I/R的防治方法提供新的理論探討和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　選用

2、SPF級(jí)雄性Wistar大鼠200只，取材前體重180g-220g，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠隨機(jī)分為五組：假手術(shù)組（Shame operation group,S組）、模型組（Model group,M組）、電針預(yù)處理組（electroacupuncture pretreatment group,EA組）、抑制劑預(yù)處理組（SB203580 group,SB組）和電針+抑制劑預(yù)處理組（electroacupuncture pretreat

3、ment+SB203580 group,EA+SB組）。假手術(shù)組：常規(guī)飼養(yǎng)，捆綁1次/天，共7天，第8天手術(shù)過(guò)程中，只開胸穿線，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支；模型組：捆綁1次/天，共7天，第8天通過(guò)采用推管法行左冠狀動(dòng)脈缺血再灌注術(shù)，制備在體心肌缺血再灌注模型；抑制劑預(yù)處理組：捆綁1次/天，共7天，第8天將p38MAPK抑制劑SB203580溶于二甲基亞砜成20％溶液，在造模前給予0.3mg/kg皮下注射，后造模過(guò)程同模型組；電針預(yù)處理組：捆

4、綁1次/天。電針雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴操作，直刺深度約5mm,采用HANS-200型電針治療儀，選用連續(xù)波，頻率2Hz，強(qiáng)度1mA，電針預(yù)處理1次/天，通電治療20min。共7天，后造模過(guò)程同模型組；電針+SB203580預(yù)處理組：捆綁1次/天，共7天，電針預(yù)處理過(guò)程同電針預(yù)處理組，第8天造模前給予抑制劑SB203580皮下注射，過(guò)程同抑制劑預(yù)處理組，后造模過(guò)程同模型組。復(fù)灌即刻，利用生物信號(hào)及壓力測(cè)試系統(tǒng)（BL-Newcentury410）測(cè)定大

5、鼠左心室心功能指標(biāo)（舒張末期壓力、左室收縮期平均壓、短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)），后處死大鼠，取血清待檢，剪取心臟，稱取梗死區(qū)重量和全心重量，分別計(jì)算心肌梗死區(qū)重量和全心重量的比值。TTC染色法分析心肌梗死面積，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌鈣蛋白 I（cTnI），采用比色法檢測(cè) ROS含量，采用黃嘌呤氧化法檢測(cè)心肌超氧化物歧化酶（SOD）活性，硫代巴比妥酸法檢測(cè)心肌丙二醛（MDA）含量，高效液相色譜法

6、計(jì)算心肌組織中ATP的含量。利用激光共聚焦顯微鏡、HE染色和透射電鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞尤其是線粒體的形態(tài)變化。
　　結(jié)果：
　?。?）M組的梗死面積和梗死程度的比值，與 S組相比較，均顯著升高（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的梗死面積和梗死程度的比值均較M組有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組、EA+SB組和SB組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　?。?）M組的LVEDP與S組相比較，顯著升

7、高（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的LVEDP均較M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， EA組、EA+SB組和SB組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。M組的LVSP、FS、EF值與S組相比較，顯著升高（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的LVSP、FS、EF值均較M組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組、EA+SB組和SB組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　（3）M組的LDH

8、、CK及cTnI與S組相比較，顯著升高（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的LDH、CK及cTnI均較M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的LDH、CK與EA+SB組和SB組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。EA組和EA+SB組的cTnI與SB組比較，有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（4）M組的 TNF-α、IL-1β和 IL-6與 S組相比較，顯著升高（P<0.05）,SB組、EA

9、組和EA+SB組的TNF-α、IL-1β和IL-6均較M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的TNF-α、IL-1β和IL-6與EA+SB組和SB組比較，顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。M組的 IL-4和 IL-10與 S組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。SB組、EA組和EA+SB組的IL-4和IL-10與M組比較，有顯著性差異（P<0.05）。各治療組之間差異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

10、　?。?）M組的ICAM-1和VCAM-1與S組相比較，顯著升高（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的ICAM-1和VCAM-1均較M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的ICAM-1和VCAM-1明顯低于EA+SB組和SB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）M組的ROS和MDA與S組相比較，顯著升高（P<0.05）,SB組、EA組和 EA+SB組的 ROS和 MDA均較 M組顯著降低，差異

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的ROS和MDA明顯低于EA+SB組和SB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。M組的SOD和ATP與S組相比較，顯著降低（P<0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的SOD和ATP均較M組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的ROS和MDA明顯高于EA+SB組和SB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?。?）與 S組比較，M組、EA組、SB組及 EA+SB組大鼠心肌細(xì)胞N

12、a+-K+-ATPase和 Ca2+-ATPase的活性明顯下降（P<0.05），EA組、SB組及EA+SB組大鼠心肌細(xì)胞 Na+-K+-ATPase和 Ca2+-ATPase的活性較M組明顯提高（P<0.05），EA組中 Na+-K+-ATPase和 Ca2+-ATPase的改善明顯優(yōu)于SB組及EA+SB組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?）M組的MKK3/6、p38及p-p38蛋白表達(dá)與S組相比較，顯著升高（P<

13、0.05）,SB組、EA組和EA+SB組的MKK3/6、p38及p-p38蛋白表達(dá)均較M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），EA組的MKK3/6、p38及 p-p38蛋白表達(dá)數(shù)值低于EA+SB組和 SB組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）S組正常心肌纖維排列規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核及線粒體形態(tài)和數(shù)量正常，線粒體嵴清晰，心肌間未見異常。M組心肌肌纖維出現(xiàn)溶解斷裂甚至壞死，間質(zhì)增大，腫脹明顯。部分線粒體固縮

14、變小，部分線粒體腫脹、或外膜破損。線粒體嵴不規(guī)則、斷裂成絮狀或缺失。EA組、SB組及EA+SB組肌纖維間隙輕度增寬，壞死灶減輕，心肌細(xì)胞輕微腫脹，細(xì)胞核及線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，小部分線粒體仍存在空泡樣病變。
　　結(jié)論：
　　1.電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可使I/R模型大鼠心肌梗死面積和梗死程度明顯下降，可減輕線粒體腫脹和壞死程度，減輕心肌細(xì)胞間炎癥因子浸潤(rùn)，病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)提示電針可顯著改善受損心肌組織的病理?yè)p害程度。
　　2.電

15、針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可使I/R模型大鼠LVEDP降低，LVSP、FS和EF升高，可降低血清中LDH、CK及cTnI的含量，保護(hù)大鼠心肌組織，改善大鼠心功能。
　　3.電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6等炎性因子的表達(dá)，增加 IL-4和 IL-10等抗炎因子的表達(dá)，可以下調(diào)心肌粘附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)因子保護(hù)受損心肌組織。
　　4.電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可以減少 I/R

16、模型大鼠心肌細(xì)胞 ROS及 MDA的含量，提高的ATP含量，激活SOD和ATP酶的活性，改善RCR，通過(guò)保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整性來(lái)減輕I/R中心肌損傷。
　　5.MKK3/6/p38MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與在體I/R模型大鼠的病理過(guò)程， I/R中大鼠MKK3/6和p38MAPK表達(dá)上調(diào)，電針“內(nèi)關(guān)”預(yù)處理可以明顯抑制I/R中MKK3/6、p38MAPK的蛋白表達(dá)，抑制p38MAPK的磷酸化，對(duì)心肌細(xì)胞p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)可