大黃素衍生物對淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株Molt-4及CA-46的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：1、設(shè)計合成23種大黃素衍生物E1~E23，從中篩選出抑制白血病細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的衍生物。2、研究大黃素衍生物對兩種淋巴系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞株Molt-4及CA-46細(xì)胞增殖、凋亡的影響。3、觀察大黃素衍生物對Molt-4、CA-46細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響。4、觀察大黃素衍生物對磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）、絲裂

2、素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路及Hedgehog信號通路（Hh通路）的作用。
　　方法：以大黃素為母體合成23種大黃素衍生物E1~E23，從中篩選出大黃素衍生物E19進(jìn)行實驗。MTT比色法及細(xì)胞集落形成實驗觀察大黃素衍生物E19對Molt-4、CA-46細(xì)胞增殖的影響；DAPI染色法熒光顯微鏡下觀察衍生物作用后的細(xì)胞形態(tài)變化；DNA片段化、半胱氨酸蛋白酶3（casp

3、ase-3）酶活性檢測大黃素衍生物E19誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；蛋白印跡法（Western blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，Pin1）、Caspase-9前體（procaspase-9）、procaspase-3、多聚ADP核糖聚合酶（poly(ADP-ribose)polymerase，PARP）及PI3K/AKT、MAPK通路蛋白表達(dá)的變

4、化；相對定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Relative quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR）檢測大黃素衍生物E19作用前后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2、c-myc、人類端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（Human telomerase reverse transcriptase，hTERT）及Hedgehog信號通路相關(guān)分子mRNA水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1、MTT結(jié)果顯示，大黃素衍生物E10

5、~E19作用K562細(xì)胞48h的IC50在0.84~12.01μmol/L之間。大黃素衍生物E1~E9、E20~E23作用于CA-46、Molt-4細(xì)胞48h的IC50分別在1.84~17.47μmol/L、1.40~13.93μmol/L之間。E19對U937、NB-4、Molt-4、CA-46細(xì)胞48h的IC50在0.76~0.90μmol/L之間。2、MTT結(jié)果顯示大黃素衍生物E19作用Molt-4、CA-46細(xì)胞48h的半數(shù)抑制

6、濃度（IC50）分別為0.9816±0.0657μmol/L和0.824±0.0763μmol/L。細(xì)胞集落形成實驗均顯示大黃素衍生物E19能明顯抑制兩種細(xì)胞集落的形成，并在一定范圍內(nèi)呈濃度及時間依賴性。3、DAPI染色后在熒光顯微鏡下能看到衍生物組Molt-4、CA-46細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變；DNA片段化可觀察到典型的DNA凋亡梯帶。同時衍生物組的caspase-3酶活性檢測結(jié)果顯示Molt-4、CA-46細(xì)胞中caspase

7、-3活性隨著藥物濃度的增加而顯著升高。4、不同濃度的大黃素衍生物E19作用Molt-4、CA-46細(xì)胞48h，bcl-2、procaspase-9、procaspase-3、procaspase-8、MAPK、磷酸化MAPK(p-MAPK)、AKT、p-AKT、人雷帕霉素靶蛋白（Human mammalian target of rapamyein，mTOR）、p-mTOR、p-4BEP1、核糖體S6蛋白激酶（Ribosomal pro

8、tein S6 kinase，P70）、p-P70、p-CrkL、Pin1表達(dá)均下調(diào)，4EBP1、CrkL的表達(dá)變化不明顯。1.6μmol/L的E19作用兩種細(xì)胞株不同時間后，4EBP1及P70蛋白表達(dá)變化不大，MAPK、p-MAPK、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4BEP1、p-P70、CrkL、p-CrkL、Pin1蛋白表達(dá)下調(diào)。5、不同濃度的大黃素衍生物E19作用Molt-4、CA-46細(xì)胞48h，bcl-2、h

9、-TERT、Sonic Hedgehog（Shh），Hh通路膜受體蛋白Smoothened（Smo），Hh通路膜受體蛋白Patched（Ptch），Hh通路下游核轉(zhuǎn)錄因子（glioma-associated oncogene homolog，Gli-1）等基因mRNA水平表達(dá)下調(diào)，bax表達(dá)上調(diào)，c-myc表達(dá)變化不大。
　　結(jié)論：1、在合成的23種大黃素衍生物中，E19對白血病細(xì)胞的抑制增殖作用最強(qiáng)。2、大黃素衍生物E19對Mo