PB轉(zhuǎn)座子和To12轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因長(zhǎng)期表達(dá)的研究.pdf

1、第—部分量化檢測(cè)SEAP報(bào)告基因方法的探索
　　目前對(duì)SEAP報(bào)告基因的檢測(cè)普遍是通過(guò)檢測(cè)SEAP反應(yīng)吸光值的方法來(lái)進(jìn)行的，然而，由于吸光值檢測(cè)會(huì)受到實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響，所以，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)SEAP檢測(cè)的結(jié)果很難進(jìn)行比較分析，限制了SEAP報(bào)告基因的應(yīng)用。因此，十分需要建立一種對(duì)SEAP基因的表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。
　　我們建立了一種可以在不同實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)檢測(cè)SEAP反應(yīng)的吸光值計(jì)算出SEAP蛋白質(zhì)量的方法，對(duì)SEA

2、P檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以進(jìn)行準(zhǔn)確的比較分析，為SEAP報(bào)告基因更好的應(yīng)用于科學(xué)研究中提供了支持。
　　方法:
　　通過(guò)建立SEAP反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)Lambert-Beer定律:A=ε×c×d，計(jì)算出我們實(shí)驗(yàn)條件下的對(duì)硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，結(jié)合SEAP酶的比活，進(jìn)而推導(dǎo)出SEAP反應(yīng)吸光值與SEAP質(zhì)量之間的關(guān)系式，可以應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞上清和小鼠血清中SEAP的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　建立了一種可以

3、應(yīng)用于在不同實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)檢測(cè)SEAP反應(yīng)的吸光值計(jì)算出SEAP蛋白質(zhì)量的方法。推導(dǎo)出在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，待測(cè)樣品中SEAP濃度（μg·L-1）的計(jì)算公式為:c=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)，所以，SEAP蛋白質(zhì)量（μg）的計(jì)算公式為:m=△A/min×33.35×稀釋倍數(shù)×樣品體積。我們將得到的公式成功的應(yīng)用于細(xì)胞上清和小鼠血清中SEAP量的檢測(cè)。在小鼠尾靜脈快沖實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到小鼠體內(nèi)SEAP的表達(dá)量隨著時(shí)間的推移逐漸降低。<

4、br>　　結(jié)論:
　　我們建立了一種可以將SEAP檢測(cè)從對(duì)吸光值的比較上升到可進(jìn)行量化比較的方法，并且該方法能夠應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)的條件，為SEAP報(bào)告基因更好的應(yīng)用提供了支持。
　　第二部分 PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因長(zhǎng)期表達(dá)作用的初步探索
　　轉(zhuǎn)座子(Transposon)是一類相對(duì)獨(dú)立的DNA片段，能夠在宿主基因組中通過(guò)“剪切和粘貼”的機(jī)制發(fā)生位置的移動(dòng)，其移動(dòng)位置的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)座(Transposition)

5、。由于具有轉(zhuǎn)座的功能，轉(zhuǎn)座子作為一種分子遺傳學(xué)工具被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因和插入突變等研究中，轉(zhuǎn)座子現(xiàn)在已成為生命科學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。
　　使用病毒載體可以使基因有效地整合到基因組中，但是病毒載體存在可攜帶的DNA片段較小和制作成本較高等問(wèn)題，限制了病毒載體的使用。轉(zhuǎn)座子同樣具有促進(jìn)基因整合到基因組中并實(shí)現(xiàn)整合基因長(zhǎng)期表達(dá)的功能，同時(shí)，使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)僅需將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞中即可發(fā)揮轉(zhuǎn)座作用，而且轉(zhuǎn)座子還具有DNA運(yùn)載容量大和制作成本低等

6、優(yōu)點(diǎn)。我們選擇了應(yīng)用比較廣泛的Tol2轉(zhuǎn)座子和piggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子作為實(shí)驗(yàn)材料，在CHO細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中對(duì)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因長(zhǎng)期表達(dá)的情況進(jìn)行了探索，為轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)應(yīng)用于基因長(zhǎng)期表達(dá)的研究提供了支持。
　　方法:
　　我們首先在CHO細(xì)胞中用帶有熒光蛋白表達(dá)框架的PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)量的變化情況，探索了轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)熒光蛋白基因長(zhǎng)期表達(dá)的情

7、況。接著，我們采用了可以進(jìn)行定量比較的SEAP報(bào)告基因在HEK293T細(xì)胞和CHO細(xì)胞中進(jìn)行了轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)采集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行SEAP表達(dá)量的實(shí)時(shí)檢測(cè)，探索了轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)SEAP基因長(zhǎng)期表達(dá)的情況。
　　結(jié)果:
　　用PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，用熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)座子能夠介導(dǎo)熒光蛋白持續(xù)表達(dá)超過(guò)一個(gè)月。PB轉(zhuǎn)座子和Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞和CHO細(xì)胞后，跟蹤檢測(cè)SE