農(nóng)桿菌介導(dǎo)巨桉無性系Eg5遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本文以巨桉Eg5生根苗葉片為外植體，進行了抗生素敏感性實驗，及農(nóng)桿菌GV3101和LBA4404介導(dǎo)Eg5影響因素的研究，建立了兩種農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，經(jīng)GUS染色和PCR檢測證實獲得了農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化的GUS基因植株。本文研究結(jié)論如下：
　　1.巴龍霉素抑制外植體再生能力非常強，濃度達(dá)到7.14 mg·L-1時可完全抑制葉片再生，達(dá)到14.27 mg·L-1可完全抑制外植體愈傷的形成；外植體愈傷組織增殖階段適宜的卡那霉

2、素篩選質(zhì)量濃度為17.5 mg·L-1；卡那霉素質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg·L-1時，可完全抑制愈傷組織芽分化；卡那霉素質(zhì)量濃度達(dá)到400 mg·L-1時，再生芽的生根率則降低為0，完全抑制再生芽的生根；頭孢霉素在0~500 mg·L-1范圍內(nèi)試驗結(jié)果表明0~300 mg·L-1的頭孢霉素對外植體的生長分化影響小；共培養(yǎng)結(jié)束后外植體經(jīng)過500 mg·L-1的頭孢霉素處理，培養(yǎng)基中添加100 mg·L-1的頭孢霉素便可完全抑制農(nóng)桿菌GV310

3、1、LBA4404的生長。
　　2. GV3101、LBA4404和EHA105三種菌株的瞬時表達(dá)率和瞬時表達(dá)率指數(shù)分別達(dá)到64.43％、49.54%、48.10%和0.35、0.32、0.27，不同菌株之間無顯著差異，但以菌株GV3101和LBA4404的瞬時轉(zhuǎn)化效果最佳。
　　經(jīng)過試驗優(yōu)化后農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化Eg5的技術(shù)參數(shù)如下：葉片外植體預(yù)培養(yǎng)時間為3 d，菌液光密度值OD600nm為0.5，侵染葉片外植體30~6

4、0 min，且以60 min為最佳，共培養(yǎng)pH值維持在5.8-6.0之間，共培養(yǎng)基中添加150mg·L-1乙酰丁香酮，共培養(yǎng)1 d。
　　農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化Eg5的研究表明：在葉片外植體預(yù)培養(yǎng)3 d，菌液濃度OD600nm值為0.5時，侵染葉片外植體45 min，于pH值5.8共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3 d，瞬時轉(zhuǎn)化效果最佳。正交試驗表明共培養(yǎng)時間是影響遺傳轉(zhuǎn)化的顯著因素。
　　3.農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化未獲得轉(zhuǎn)化G