多潛能C3H-10T1-2細(xì)胞增殖、分化相關(guān)新基因的捕獲、克隆及功能研究.pdf

1、本課題擬以10T1/2細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞模型,重點研究基因捕獲技術(shù)捕獲的在MSCs有轉(zhuǎn)錄活性的基因,并以TGF-β1為細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子,研究MSCs的增殖、多向分化及相關(guān)機(jī)制,豐富MSCs促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的理論基礎(chǔ)。本研究獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.C3H/10T1/2細(xì)胞表型鑒定及多向分化的實驗研究
　　 通過流式細(xì)胞儀鑒定10T1/2細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31,造血干細(xì)胞表面抗原CD34,造血細(xì)胞表面抗

2、原CD45,但表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105等干細(xì)胞表面抗原。用TGF-β1誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞向平滑肌分化,24 h后誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特征性的“峰谷”樣生長外觀,RT-PCR證實αSMA、SM22a、SM-MHC、SRF等平滑肌分化相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng),免疫熒光實驗證實α SMA蛋白表達(dá)增強(qiáng),Western blot證實α SMA、SM22a蛋白表達(dá)增強(qiáng),說明成功建立TGF-β1誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞平滑肌分化模型。用V

3、EGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞成內(nèi)皮分化,9天后誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特征性“鵝卵石”樣外觀,RT-PCR發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮分化相關(guān)基因Fit1、Flk1、Ang2、Tie2、VE-cadherin、CD31、Ang1、Vezf1、Notch1、Jagged1和EphB4/EphrinB2誘導(dǎo)后表達(dá)逐漸增強(qiáng),但不表達(dá)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志Flt4,說明誘導(dǎo)后細(xì)胞不是淋巴內(nèi)皮細(xì)胞。免疫細(xì)胞熒光染色顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志CD31、Fa

4、ctorⅧ和VE-cadherin。透射電鏡下觀察誘導(dǎo)后細(xì)胞胞漿存在Weibel-Palade小體和豐富的胞飲小泡。Dil-ac-LDL吞噬實驗表明分化后細(xì)胞具有吞噬ac-LDL的功能,Ⅰ型膠原三維成血管實驗顯示分化后細(xì)胞在體外三維培養(yǎng)中能形成血管樣結(jié)構(gòu),說明誘導(dǎo)后細(xì)胞不但表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志且具有內(nèi)皮細(xì)胞功能。三維成血管后α SMA/CD31免疫熒光雙標(biāo)實驗顯示10T1/2細(xì)胞自身表達(dá)中等強(qiáng)度α SMA,但在分化誘導(dǎo)后表達(dá)逐漸降低,而CD

5、31表達(dá)逐漸增強(qiáng),說明VEGF和bFGF聯(lián)合誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞成內(nèi)皮分化時并不存在同時向平滑肌分化的現(xiàn)象。用5-氮雜胞苷誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞17天后可見粗大肌管形成,但此誘導(dǎo)并非特異性誘導(dǎo),誘導(dǎo)15天后少量細(xì)胞出現(xiàn)了微小脂滴,并逐步融合變大,25天后形成典型的脂肪細(xì)胞,油紅染色可見脂滴。用維生素C、β-磷酸甘油、地塞米松誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞成骨分化,第21天茜素紅染色可見紅色骨結(jié)節(jié)。用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素誘導(dǎo)1

6、0T1/2細(xì)胞成脂分化,第15天油紅染色可見脂滴。用bFGF、β-巰基乙醇、二甲基亞砜誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞成神經(jīng)元分化,第3天出現(xiàn)類似神經(jīng)元樣細(xì)胞,15天時免疫細(xì)胞化學(xué)檢測神經(jīng)元標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶仍為陽性,說明誘導(dǎo)后細(xì)胞為神經(jīng)元樣細(xì)胞。體外培養(yǎng)貼壁生長、細(xì)胞表面抗原鑒定及有多向分化的潛能說明10T1/2細(xì)胞是良好的間充質(zhì)干細(xì)胞模型。
　　 2.多用途基因捕獲C3H/10T1/2細(xì)胞陽性克隆庫的建立及鑒定
　　 用

7、含LacZ為報告基因的PolyA基因捕獲載體ROSAFARY轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix,收集病毒上清,感染10T1/2細(xì)胞,并以潮霉素篩選整合了基因捕獲載體的陽性細(xì)胞克隆。測試不同濃度潮霉素對10T1/2細(xì)胞的毒性,以7天殺死全部細(xì)胞確立潮霉素對10T1/2的最佳篩選濃度為150 mg/l。以150 mg/l潮霉素篩選共獲得103個克隆,經(jīng)以插入載體ROSAFARY的LacZ為目的基因的細(xì)胞基因組DNA PCR及LacZ染色鑒定最終建立

8、了含64個不同克隆的10T1/2細(xì)胞基因捕獲陽性克隆庫,其中6個LacZ染色陽性,說明捕獲到部分干細(xì)胞中高表達(dá)的基因,其余細(xì)胞克隆LacZ染色呈陰性,說明捕獲的是干細(xì)胞低或不表達(dá)的基因。
　　 3.TGF-β1誘導(dǎo)后表達(dá)下調(diào)捕獲基因的分離及生物信息學(xué)分析
　　 TGF-β1誘導(dǎo)前期建立的10T1/2細(xì)胞基因捕獲陽性克隆庫平滑肌分化,對分化前后的細(xì)胞進(jìn)行LacZ染色篩選獲得3個平滑肌分化后表達(dá)下調(diào)克隆,通過RACE等分子生

9、物學(xué)技術(shù)及電子克隆分離獲得差異表達(dá)序列,使用GenBank網(wǎng)站nblast進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明為一個已知基因Mrps6和兩個新基因。Mgt-6位于14號染色體,包括4個轉(zhuǎn)錄本,翻譯2個蛋白質(zhì),用GenBank網(wǎng)站在線投遞軟件BankIt提交后獲ID號,轉(zhuǎn)錄本1、2和3含3個外顯子,編碼短蛋白,用pI/Mw批量計算軟件計算蛋白分子量為1414.68,等電點為5.75,轉(zhuǎn)錄本4含2個外顯子,編碼長蛋白,計算其分子量為4073.57,

10、等電點為6.52。Mgt-16基因位于19號染色體,含2個外顯子,編碼一個93個氨基酸的蛋白,計算其分子量為9772.02,等電點為6.04,提交GenBank網(wǎng)站獲ID號。最后提取6、16號基因捕獲克隆RNA進(jìn)行RT-PCR后測序驗證了捕獲載體ROSAFARY插入在mgt-6、mgt-16第一個內(nèi)含子中,并獲取ROSAFARY載體精確的剪接受體位點在其2754nt處。
　　 4.新基因mgt-16的克隆及功能研究
　　

11、 以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL-EGFP-N1為基礎(chǔ)經(jīng)測序證實成功構(gòu)建mgt-16融合EGFP的過表達(dá)載體pL-EGFP-N1-16,轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix后收集病毒感染10T1/2細(xì)胞,以400μg/ml G418篩選建立了穩(wěn)定表達(dá)mgt-16融合EGFP的細(xì)胞克隆,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光只出現(xiàn)在胞漿,證實MGT-16蛋白在細(xì)胞胞漿表達(dá),與16號克隆正常培養(yǎng)下LacZ染色結(jié)果一致。
　　 以載體pL-EGFP-N1和pIRES2

12、-EGFP-N1為基礎(chǔ)經(jīng)測序證實成功構(gòu)建含內(nèi)核糖體插入序列逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL-IRES-EGFP-N1,再以pL-IRES-EGFP-N1為基礎(chǔ)成功構(gòu)建mgt-16融合6×His標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pL-IRES-EGFP-16-His,轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞Phoenix后收集病毒感染10T1/2細(xì)胞,400μg/mlG418篩選獲得mgt-16融合6×His且?guī)RES-EGFP的穩(wěn)定表達(dá)克隆。以pL-IRES-EGFP-N1感染的10T1/

13、2細(xì)胞為對照,GAPDH為內(nèi)參,Western blot檢測平滑肌分化相關(guān)基因αSMA和SM22a,結(jié)果表明過表達(dá)mgt-16可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的10T1/2細(xì)胞平滑肌分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示:16號克隆24 h細(xì)胞傷口愈合面積百分率較正常10T1/2細(xì)胞低,說明mgt-16基因被打斷后可使細(xì)胞遷移減慢;而無論是mgt-16融合EGFP還是mgt-16融合His的過表達(dá)10T1/2細(xì)胞24 h細(xì)胞傷口

14、愈合面積百分率均比其對照組高,說明mgt-16基因過表達(dá)后可使細(xì)胞遷移加快。通過比較mgt-16基因低表達(dá)和過表達(dá)兩種細(xì)胞模型的效應(yīng)差異,均表明mgt-16基因為細(xì)胞增殖、遷移正相關(guān)基因。
　　 5.TGF-β1下調(diào),mgt-16表達(dá)參與平滑肌分化的分子機(jī)制
　　 16號克隆用TGF-β1、p38/RK抑制劑、PI3K/AKT抑制劑、ERK抑制劑、mTOR抑制劑、NF-κB抑制劑,以及單一抑制劑聯(lián)合TGF-β1處理24

15、h,LacZ染色及RT-PCR結(jié)果均表明TGF-β1是通過激活P38信號通路引起mgt-16表達(dá)降低。接著我們發(fā)現(xiàn):①p38抑制劑可抑制TGF-β1對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;②Western blot檢測TGF-β1可使P38磷酸化蛋白增加及SB203580可抑制此效應(yīng);③RT-PCR證實SB203580可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的平滑肌分化相關(guān)基因SM22a的表達(dá)。此三點表明TGF-β1通過激活P38信號通路誘導(dǎo)10T1/2細(xì)胞平滑肌分化。至此

16、,提出假說:TGF-β1可能通過激活P38信號通路下調(diào)mgt-16基因而調(diào)控10T1/2細(xì)胞平滑肌分化。
　　 6.新基因mgt-6的克隆及功能研究
　　 6號克隆正常培養(yǎng)及5-氮雜胞苷處理后LacZ染色均顯示正常情況下mgt-6在細(xì)胞胞漿表達(dá),而5-氮雜胞苷處理后可發(fā)生核轉(zhuǎn)位,并由構(gòu)建mgt-6融合EGFP的真核表達(dá)載體pEGFP-N1-6轉(zhuǎn)染10T1/2細(xì)胞觀察綠色熒光亞細(xì)胞定位所證實,提示新基因mgt-6可能參與了

17、細(xì)胞DNA低甲基化效應(yīng)。此外,RT-PCR結(jié)果表明mgt-6含四個轉(zhuǎn)錄本且在小鼠不同組織及不同細(xì)胞系有不同表達(dá)。皮膚、脾、小腸、腎臟、心臟和骨骼肌主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄本4,而肝臟主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1,腦和肺臟4個轉(zhuǎn)錄本均有較強(qiáng)表達(dá)。C2C12主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄本4,而10T1/2細(xì)胞和Lewis細(xì)胞4個轉(zhuǎn)錄本均有較強(qiáng)表達(dá)且轉(zhuǎn)錄本1、2、4在Lewis細(xì)胞表達(dá)較10T1/2細(xì)胞表達(dá)要高。小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系C2C12和成年小鼠骨骼肌組織均主要表達(dá)轉(zhuǎn)錄本4而

18、弱表達(dá)轉(zhuǎn)錄本1、2、3,提示MGT-6L或MGT-6S可能與骨骼肌形成或分化有關(guān)。6號克隆正常培養(yǎng)、TGF-β1、p38/RK抑制劑、PI3K/AKT抑制劑、ERK抑制劑處理24 h后LacZ染色以及10T1/2細(xì)胞正常培養(yǎng)、TGF-β1及不同抑制劑處理24 h后RT-PCR,結(jié)果均表明TGF-β1及PD98059處理可使mgt-6表達(dá)下調(diào),而SB203580及LY294002處理可使mgt-6表達(dá)上調(diào),提示mgt-6可能與平滑肌分化有