BMP9聯合Wnt3a誘導C3H10T1-2細胞向心肌細胞樣細胞分化的研究.pdf

1、第一部分擴增重組腺病毒GFP、Wnt3a、BMP9并分別轉染C3H10T1/2細胞
　　目的：擴增能高度表達GFP、Wnt3a、BMP9蛋白的重組腺病毒，并檢測分別轉染C3H10T1/2細胞后的穩(wěn)定性。
　　方法：復蘇HEK293細胞并培養(yǎng)，待其增殖生長至約培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％，進行反復傳代兩次后，向細胞中分別加入適量的AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9原液，搖晃均勻后培養(yǎng)48～72h觀

2、察細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變后，即可收集細胞懸液。于倒置相差顯微鏡下觀察復蘇培養(yǎng)的C3H10T1/2細胞，待其生長鋪滿至約培養(yǎng)瓶底面積的70％時，加入適量已成功收集的腺病毒液，48h后利用熒光顯微鏡和流式細胞術分別觀察腺病毒轉染后的細胞生長變化及轉染效率。
　　結果：1、AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9在HEK293細胞中反復擴增后，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，即收集到了能夠高度表達GFP、Wnt3a、BM

3、P9蛋白的腺病毒液。
　　2、鏡下觀察經BMP9、Wnt3a及二者聯合轉染C3H10T1/2細胞1周后，可見BMP9組、Wnt3a聯合BMP9組細胞呈現纖維樣生長排列，方向漸趨于一致，連接緊密；Wnt3a組細胞呈長梭形生長，排列則較為紊亂。
　　3、利用流式細胞術得到經GFP、Wnt3a、BMP9及二者聯合轉染C3H10T1/2細胞48h后的轉染效率均約為60％。
　　結論：AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、

4、AdEasyBMP9原液在HEK293細胞中反復擴增后可以收集到高度表達的腺病毒液；分別轉染C3H10T1/2細胞后各組細胞生長形態(tài)良好，并可獲得較高和較穩(wěn)定的轉染效率。
　　第二部分 Wnt3a單獨及聯合BMP9誘導C3H10T1/2細胞向心肌細胞樣細胞分化的作用
　　目的：研究經Wnt3a單獨以及Wnt3a聯合BMP9轉染C3H10T1/2細胞后其向心肌細胞樣細胞分化的初步作用。
　　方法：將C3H10T1/2細胞

5、隨機分為5組：①空白組；②GFP組；③Wnt3a組；④BMP9組；⑤Wnt3a聯合 BMP9組。AdEasyGFP、AdEasyWnt3a、AdEasyBMP9分別轉染C3H10T1/2細胞3周后，利用Western blot和免疫熒光技術檢測各組細胞中縫隙連接蛋白43（Cx43）、心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達差異；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各組細胞中 GATA結合蛋白4（GATA4）、心肌細胞增強因子2C（MEF2C

6、）的表達變化。
　　結果:C3H10T1/2細胞經腺病毒轉染3周后仍可穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白。Western blot和 qRT-PCR結果顯示Wnt3a組細胞心肌特異性蛋白Cx43、cTnT，基因GATA4、 MEF2C的表達量與空白組比較無明顯差異；Wnt3a聯合BMP9組細胞中Cx43、cTnT、GATA4、MEF2C的表達量顯著高于空白組、GFP組和Wnt3a組，而與單獨BMP9組相比無顯著性差異。
　　結論：Wnt3