人胚胎干細(xì)胞自我更新相關(guān)新基因的克隆及功能研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)來源于胚胎發(fā)育囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，可以分化成機(jī)體三個(gè)胚層來源的所有組織細(xì)胞。為了探索和揭示除Oct4、Nanog、Sox2外其它維持人ES細(xì)胞多潛能性的基因及其功能，更深入地闡明人ES細(xì)胞自我更新的復(fù)雜機(jī)制，本課題開展了人ES細(xì)胞自我更新相關(guān)基因的高通量篩選，并且進(jìn)行了人ES細(xì)胞自我更新相關(guān)新基因的克隆和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。 【人胚胎干細(xì)胞和擬胚體基因表達(dá)譜的初步分析

2、】 基因芯片為高通量基因表達(dá)研究提供了一個(gè)有利工具。本研究中采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片分析比較了未分化人ES細(xì)胞(H9)和分化7天的擬胚體(7-day embryoid bodies，7-day EBs)基因表達(dá)譜，檢測(cè)到在人ES細(xì)胞分化形成的7-day EBs中約1100個(gè)基因表達(dá)下調(diào)大于2倍及2200個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上，并通過real-time PCR證

3、實(shí)了芯片結(jié)果的可靠性。在表達(dá)下調(diào)2倍及以上的基因中，包含了許多已經(jīng)證實(shí)在維持人ES細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用的基因。此外，基因芯片檢測(cè)結(jié)果中包含了大量未知基因(假定蛋白和EST序列)，這些未知基因在人ES細(xì)胞分化時(shí)表達(dá)顯著改變，但它們的完整基因序列目前仍未獲得。其中兩個(gè)EST序列(GenRank登錄號(hào)：BF223023、BC020935)在人ES細(xì)胞中表達(dá)水平較高，尤其是BF223023在未分化人ES細(xì)胞中表達(dá)水平與Oct4和Nanog

4、相似，而當(dāng)人ES細(xì)胞分化形成EBs時(shí)其表達(dá)顯著下調(diào)(19.7倍)，并且在多篇文獻(xiàn)報(bào)道的芯片結(jié)果中均有出現(xiàn)，提示我們?cè)揈ST所代表的基因可能與人ES細(xì)胞自我更新調(diào)控相關(guān)。 【人胚胎干細(xì)胞特異性高表達(dá)新基因的克隆和鑒定】 將BF223023作為種子序列，在人EST數(shù)據(jù)庫中尋找與其匹配的序列，之后利用手工方法將所檢索到的EST重疊群拼接獲得一個(gè)長度約2330bp的序列。檢索NCBI網(wǎng)站的人類非冗余基因數(shù)據(jù)庫未發(fā)現(xiàn)其它基因與該序

5、列匹配，說明該基因是一個(gè)新基因，我們將其命名為人胚胎干細(xì)胞相關(guān)基凼(Human embryonic stem cell related gene，HESRG)(GenBank登錄號(hào)：DQ445779)。HESRG新基因序列3’端包含一個(gè)polyA尾及AATAAA加尾信號(hào)，說明該序列包含完整3’非翻譯區(qū)。但是從基因序列分析尚不能確定其5’末端完整性，因此我們利用Smart RACE PCR試劑盒擴(kuò)增該基因完整的5’末端。最終我們得到：HE

6、SRG 基因cDNA序列的全長為3141bp，定位于人類染色體3p14.3。將該基因與NCBI中非冗余核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示HESRG基因僅與人類及類人猿的基因組序列匹配，在其它物種中均未發(fā)現(xiàn)有相似序列，提示HESRG基因可能是一種靈長類動(dòng)物ES細(xì)胞特異性表達(dá)的新基因。 通過Northern blot確定在人ES細(xì)胞中HESRG的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別是3.1Kb和1.2Kb。利用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder在線程序預(yù)測(cè)H

7、ESRG基因編碼框架(open reading frame，ORF)。結(jié)果顯示HESRG的mRNA序列包含兩個(gè)候選ORFs，它們均可能編碼蛋白質(zhì)。候選ORF-1的起始密碼子CTG位于2-4bp處，終止密碼子位于668-670bp處；候選ORF-2的起始密碼子ATG位于2245-2247bp處，終止密碼子位于2485-24.87bp處。ORF-1編碼包含222個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)HESRP-1，預(yù)測(cè)分子量為24KD，理論等電點(diǎn)為9.37，包含

8、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)及蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，在線軟件LOCtree預(yù)測(cè)該蛋白表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi)。HESRP-1與多個(gè)假定蛋白有較高同源性，并與核糖核苷酸二磷酸還原酶(RNR)及E2F家族成員E2F-7有部分同源性。根據(jù)生物信息學(xué)分析我們推測(cè)HESRP-1可能作為轉(zhuǎn)錄因子，參與組織發(fā)育和細(xì)胞分化過程。ORF-2編碼蛋白質(zhì)HESRP-2的預(yù)測(cè)分子量為8.7KD，理論等電點(diǎn)為5.75，無典型蛋白結(jié)構(gòu)域，含有4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ

9、磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn)，可能存在一個(gè)疏水區(qū)和2個(gè)hotloops結(jié)構(gòu)，與兩個(gè)假定蛋白序列具有較高同源性。由于HESRP-2缺少保守結(jié)構(gòu)域、缺乏已知同源蛋白，因此較難預(yù)測(cè)其功能。 啟動(dòng)子是控制轉(zhuǎn)錄起始，并決定基因表達(dá)強(qiáng)度的序列，它在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演非常重要角色。我們提取HESRG基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp序列，采用Neural Network Promoter Prediction程序在線預(yù)測(cè)顯示，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游

10、2000bp序列中包含了多個(gè)候選啟動(dòng)子區(qū)，提示該區(qū)域可能具有啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)時(shí)，與基因調(diào)控區(qū)結(jié)合的特異性DNA序列。我們采用Transcription ElementSearch Software(TESS)程序在線預(yù)測(cè)HESRG 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的序列中包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域包含許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如Oct4、Oct1、SRY、LEF1和TCF1等。Oct4是維持人ES

11、細(xì)胞自我更新的一個(gè)關(guān)鍵基因，在人ES細(xì)胞中高表達(dá)，由此我們推測(cè)HESRG基因可能是Oct4在人ES細(xì)胞中調(diào)控的靶基因之一。以上生物信息學(xué)分析為我們開展HESRG 基因功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了線索。 HESRG基因在人ES細(xì)胞中高水平表達(dá)，而在正常胎兒組織、成人正常睪丸組織、多種腫瘤和正常細(xì)胞系中均不表達(dá)，說明HESRG基因表達(dá)具有特異性，可能僅在多潛能性干細(xì)胞中表達(dá)。為了證明HESRG基因是入ES細(xì)胞多潛能性標(biāo)志基因之一，我們采

12、用多種方法誘導(dǎo)人ES細(xì)胞分化。利用RT-PCR方法檢測(cè)HESRG、Oct4及Nanog在這些組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示在分化7天、14天、21天的EBs中HESRG表達(dá)水平較人ES細(xì)胞中顯著降低，且隨分化時(shí)間逐步降低；在維甲酸(Retinoie acid，RA)誘導(dǎo)的分化細(xì)胞和人ES細(xì)胞接種到SCID鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤中未檢測(cè)到HESRG表達(dá)。HESRG表達(dá)變化趨勢(shì)與Oct4和Nanog相似。Oct4和Nanog已被證明是ES細(xì)胞

13、多潛能性的標(biāo)志基因，在維持ES細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用，因此根據(jù)以上結(jié)果我們初步揭示HESRG是一個(gè)新的人ES細(xì)胞多潛能性標(biāo)志基因，可能參與維持人ES細(xì)胞的多潛能性。 【HESRG基因的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究】 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來興起的一項(xiàng)研究基因功能的新技術(shù)，以其簡便、高效和特異等優(yōu)點(diǎn)，漸已成為基因功能缺失研究的首選策略。為了在人ES細(xì)胞中建立高效RNAi方法，我們平行比較了

14、三種轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX(RNAiMAX)、Lioofectamine2000和Oligofectamine轉(zhuǎn)導(dǎo)siRNA進(jìn)入人ES細(xì)胞所得到的RNAi效率。結(jié)果顯示，同樣條件下RNAiMAX介導(dǎo)的RNAi效率(>80％)顯著高于其它兩種轉(zhuǎn)染試劑，說明RNAiMAX是一種高效的siRNA轉(zhuǎn)染試劑，同時(shí)也表明我們?cè)谌薊S細(xì)胞中建立了一個(gè)高效、簡便的RNA干擾方法，為我們進(jìn)一步研究人ES細(xì)胞中HESRG基因的功

15、能提供了幫助。 結(jié)合基因芯片結(jié)果、HESRG表達(dá)特征檢測(cè)及生物信息學(xué)分析，我們推測(cè)HESRG在維持人ES細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步我們利用RNAi方法探索HESRG基因在人ES細(xì)胞中的功能，研究結(jié)果顯示：當(dāng)HESRG基因表達(dá)顯著下調(diào)(約75％)時(shí)人ES細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變，由原先的緊密克隆性生長、增殖速度較快轉(zhuǎn)變成分散、細(xì)長、出現(xiàn)絲狀物、細(xì)胞增殖緩慢狀態(tài)，而非打靶序列(陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變。Real

16、-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與非打靶序列轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞相比較，干擾HESRG的細(xì)胞中多潛能性標(biāo)志基因均出現(xiàn)顯著下調(diào)；而外胚層分化標(biāo)志基因Soxl、FGF5和Nestin表達(dá)明顯升高，尤其Nestin表達(dá)升高最為顯著，其它胚層的標(biāo)志基因的改變不明顯。進(jìn)一步利用間接免疫熒光法在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)了Oct4、Nestin、Hand1、GATA4和CGD在干擾前后的表達(dá)，結(jié)果顯示：在非打靶序列轉(zhuǎn)染后的人ES細(xì)胞中Oct4高表達(dá)，而Nestin、

17、Hand1、GATA4和CGβ表達(dá)極其微弱或不表達(dá)：在HESRG干擾的細(xì)胞中出現(xiàn)較強(qiáng)的Nestin熒光信號(hào)，而Oct4的熒光信號(hào)則顯著下調(diào)，其它蛋白的熒光信號(hào)改變均不明顯。由此證明HESRG基因可以抑制人ES細(xì)胞向外胚層分化，從而參與維持人ES細(xì)胞的多潛能性。 總之，通過本課題研究，我們獲得了未分化人ES細(xì)胞和7-day EBs之間的基因表達(dá)譜及差異表達(dá)基因信息；根據(jù)一個(gè)差異表達(dá)顯著的EST序列克隆得到HESRG新基因，并對(duì)HE