維生素K2抑制大鼠血管鈣化機(jī)制研究.pdf

1、老年人、糖尿?。═ype2 Diabetes，TD2）和慢性腎功能不全（Chronic Renal Failure，CRF）晚期的患者發(fā)生心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加，其中動(dòng)脈鈣化（Arterial Calcification，AC）被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)病率和死亡率升高的重要危險(xiǎn)因素之一。血管鈣化使血管壁順應(yīng)性降低，收縮壓升高，舒張壓降低，并導(dǎo)致心臟肥大和擴(kuò)張，冠狀動(dòng)脈有效灌注量降低。AC也是評(píng)價(jià)TD2和CRF患者預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)，因此預(yù)防 A

2、C對(duì)于諸多心血管疾病的發(fā)展和治療具有重要臨床意義。但目前臨床上仍缺乏有效的治療手段。
　　AC的形成是一個(gè)受基因調(diào)控的過(guò)程，類似于骨代謝和發(fā)育的過(guò)程。然而近期也有研究報(bào)道[1,2]，在高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞（Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs）鈣化過(guò)程中，VSMCs凋亡發(fā)揮了重要作用。Proudfoot等研究也證實(shí)[3]，VSMCs釋放凋亡小體要先于鈣結(jié)晶的形成，即凋亡是鈣化形成中關(guān)鍵的一步。凋

3、亡細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡小體和磷脂酰絲氨酸分子層形成了適合鈣離子和礦物質(zhì)沉積的結(jié)合點(diǎn)，因此凋亡的VSMCs被認(rèn)為是鈣化形成的“自然發(fā)源地”。
　　維生素K（Vitamin K，VK）作為輔助因子參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后的羧基化修飾。近期有一項(xiàng)研究報(bào)道[4]，VK通過(guò)激活基質(zhì)Gla蛋白（Matrix Gla Protein，MGP）從而抑制華法林誘導(dǎo)的大鼠AC。由于VK參與了MGP谷氨酸殘基轉(zhuǎn)錄翻譯后羧基化修飾成γ-羧基谷氨酸的過(guò)程，因此該蛋白

4、被稱為維生素K依賴蛋白（VK-Dependent Protein，VKDP）。除MGP外，生長(zhǎng)抑制特異蛋白6（Growth Arrest Specific Gene6 Protein，Gas6）也是一重要的VKDP，表達(dá)于多種細(xì)胞，可與酪氨酸蛋白激酶受體（Tyro3，Axl，Mer）結(jié)合后發(fā)揮不同生物學(xué)功能如介導(dǎo)細(xì)胞存活、遷移、趨化和吞噬作用，其中抗細(xì)胞凋亡作用研究較明確。Son等研究[5]證實(shí)高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化是由于Gas6/A

5、xl抗凋亡信號(hào)通路的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡所引起的。那么VK是否能夠通過(guò)上調(diào)Gas6/Axl信號(hào)通路抑制VSMCs鈣化呢？此外由于不同器官組織細(xì)胞中蛋白羧基化修飾所需VK類型不同，肝臟中主要需要由綠葉植物合成的葉綠醌（Vitamin K1，VK1），外周組織則主要依賴于甲基萘醌（Vitamin K2，VK2），且Gas6高表達(dá)于 VSMCs。根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外取得的研究進(jìn)展，我們提出如下問(wèn)題：① VK2是否能夠抑制大鼠VSMCs鈣化形成？② VK

6、2是否能夠通過(guò)上調(diào)Gas6/Axl/p-Akt/Bcl-2信號(hào)通路的表達(dá)水平進(jìn)而抑制大鼠VSMCs鈣化呢？
　　目的:
　　1.構(gòu)建大鼠VSMCs鈣化模型，明確VSMCs鈣化與細(xì)胞凋亡相關(guān)性。
　　2.探討VK2是否能夠抑制大鼠VSMCs鈣化形成和凋亡，觀察VK2對(duì)抗細(xì)胞凋亡信號(hào)通路Gas6/Axl/p-Akt/Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響。
　　3.明確Gas6/Axl/p-Akt/Bcl-2信號(hào)通路在大鼠VS

7、MCs鈣化形成過(guò)程中的作用，闡明VK2抑制大鼠VSMCs鈣化的機(jī)制。
　　方法:
　　1.80-100 g的雄性SD大鼠2只，無(wú)菌條件下分離大鼠胸主動(dòng)脈并剪成動(dòng)脈環(huán)種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)進(jìn)行VSMCs鑒定，實(shí)驗(yàn)采用第3-8代VSMCs。
　　2.將大鼠VSMCs隨機(jī)分為對(duì)照組（Control組）和鈣化組（Ca2++ Pi組），其中Ca2++ Pi組給予含7.2 mM氯化鈣（CaCl2）和10 mMβ-甘

8、油磷酸鈉（β-Sodium Glycerophosphate，β-GP）的培養(yǎng)基，并設(shè)置4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)干預(yù)，分別為Ca2++Pi2 d組、Ca2++Pi4 d組、Ca2++Pi6 d組和Ca2++Pi8 d組。分別采用茜素紅S染色法和鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色法檢測(cè)各組VSMCs鈣結(jié)節(jié)形成情況和鈣含量。
　　3.應(yīng)用TUNEL免疫熒光染色法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組大鼠VSMCs凋亡情況并計(jì)算凋亡率。
　　4.在鈣化培養(yǎng)基干預(yù)

9、VSMCs鈣化的同時(shí)應(yīng)用凋亡抑制劑，通過(guò)鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色法和TUNEL凋亡染色法觀察細(xì)胞凋亡對(duì) VSMCs鈣化形成的影響，采用Pearson相關(guān)性分析法分析VSMCs凋亡與鈣化的相關(guān)性。
　　5.將大鼠VSMCs隨機(jī)分為對(duì)照組、Ca2++Pi組和Ca2++Pi+VK2組，其中Ca2++Pi+VK2組又根據(jù)VK2劑量不同分為4組，分別為Ca2++Pi+1μM VK2組、Ca2++Pi+5μM VK2組、Ca2++Pi+10μM V

10、K2組和Ca2++Pi+50μM VK2組。采用茜素紅S染色法和鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色法分別檢測(cè)各組VSMCs鈣結(jié)節(jié)形成情況和鈣含量。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組VSMCs凋亡情況。
　　6.采用Western Blotting免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中Gas6、Axl、p-Akt、Bcl-2表達(dá)情況。
　　7.采用鄰甲酚肽絡(luò)合酮比色法檢測(cè)不同濃度的重組鼠Gas6蛋白（Recombinant Mouse Gas6 protein，rm

11、Gas6）對(duì)VSMCs鈣化的影響，TUNEL凋亡染色法檢測(cè)不同濃度rm Gas6對(duì)VSMCs凋亡的影響。
　　8.通過(guò)Western blotting免疫印跡法篩選Axl抑制劑R428的有效作用濃度。
　　9.應(yīng)用 R428阻斷 Gas6/Axl信號(hào)通路，通過(guò)鈣含量和細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) VK2抑制VSMCs凋亡和鈣化形成狀況。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組相比，鈣化培養(yǎng)基干預(yù)VSMCs第6 d即Ca2++Pi6 d

12、組鈣結(jié)節(jié)形成及鈣含量增加（P＜0.05）；Ca2++Pi8 d組與對(duì)照組相比，鈣結(jié)節(jié)和鈣含量顯著增加（P＜0.05）；ALP活性顯著升高，細(xì)胞核上核心結(jié)核因子Runx2表達(dá)也明顯增加（P＜0.05）。
　　2. Ca2++ Pi組的細(xì)胞凋亡率升高具有時(shí)間依賴性，Ca2++ Pi6 d組凋亡率為（15.98±1.492）％，Ca2++Pi8 d組凋亡率達(dá)（22.37±2.15）%，與對(duì)照組（6.44±0.89）%相比顯著升高（P＜0

13、.001）。
　　3. VSMCs的鈣化形成及凋亡率對(duì)凋亡抑制劑（N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮，ZVAD.fmk）具有劑量依賴性，2μM ZVAD.fmk能夠顯著降低 VSMCs鈣含量和凋亡率，分別為（14.69±2.768）mg/μg和（3.867±1.55）%，對(duì)照組的鈣含量和凋亡率分別為（106.2±11.82）mg/μg和（21.07±3.037）%，兩組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。Pea

14、rson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)R2=0.8504，即細(xì)胞凋亡與鈣化具有顯著相關(guān)性（P＜0.001﹚。
　　4. VSMCs的鈣含量及凋亡率降低對(duì)VK2具有劑量依賴性。Ca2++ Pi組的鈣含量和凋亡率分別為（158±22.62）mg/μg和（19.87±2.554）%，Ca2++Pi+10μM VK2組及Ca2++ Pi+50μM VK2組鈣含量和凋亡率分別為（57.33±8.36）mg/μg、（9±1.21）%和（53.9

15、4±8.742）mg/μg、（8.1±0.793）%，與Ca2++Pi組相比，兩組均降低（P＜0.05），但是Ca2++Pi+50μM VK2組與Ca2++Pi+10μM VK2組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　5.對(duì)照組中 Gas6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值分別為（0.8187±0.096）、（0.679±0.082）、（0.959±0.089）、（0.867±0.036），Ca2++ Pi

16、組分別為（0.301±0.037）、（0.262±0.042）、（0.589±0.092）、（0.479±0.027），與對(duì)照組相比，Ca2++ Pi組Gas6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。 Ca2++Pi+10μM VK2組Gas6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白灰度值比值分別為（0.816±0.084）、（0.627±0.067）、（1.064±0.11）、（0.766±0.054），與

17、Ca2++Pi組相比，Gas6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。
　　6. Ca2++ Pi組的鈣含量和凋亡率分別為（114.4±11.15）mg/μg和（17.03±1.01）%，Ca2++Pi+400 nM rm Gas6組VSMCs的鈣含量和凋亡率降低至（48.18±15.17）mg/μg和（5±0.66）%，兩組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　7. Axl抑制劑R428

18、（2μM）可以顯著抑制Axl的功能，即抑制Akt磷酸化。與對(duì)照組（0.613±0.035）相比，Ca2++Pi+2μM R428組p-Akt蛋白與t-Akt蛋白灰度值比值降低至（0.179±0.021），兩組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。
　　8. Ca2++ Pi組的鈣含量和凋亡率分別為（141.8±27.75）mg/μg和（17.03±1.01）%；Ca2++Pi+R428組鈣含量和凋亡率分別為（218.4±18.31）

19、mg/μg和（28.3±6.86）%，與Ca2++Pi組相比明顯降低（P＜0.05）；Ca2++Pi+R428+VK2組的鈣含量和凋亡率分別為（182.3±14.46）mg/μg和（22.7±2.79）%，與Ca2++ Pi組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與Ca2++Pi+R428組相比鈣含量和凋亡率均有所降低，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　研究我們發(fā)現(xiàn)7.2 mM CaCl2聯(lián)合10 mMβ-G