維生素K2高產(chǎn)菌株的選育及其生物合成相關(guān)基因表達(dá)豐度的研究.pdf

1、維生素K2是一種重要的生理活性物質(zhì)，在凝血和骨骼代謝中都有重要的作用，近年隨著研究的深入，維生素K2對(duì)抗腫瘤抗肝癌有顯著療效，在醫(yī)藥等方面應(yīng)用更加廣泛。傳統(tǒng)的化學(xué)合成較為繁瑣且產(chǎn)量不高，本文采用誘變和原生質(zhì)體電融合選育維生素K2(MK)高產(chǎn)菌株并對(duì)其生物合成相關(guān)基因的表達(dá)豐度進(jìn)行了研究，結(jié)論如下：
　　(1)實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌BS-5為出發(fā)菌株，采用紫外和NTG相結(jié)合的方法連續(xù)誘變處理3代，經(jīng)抗性平板初篩和搖瓶復(fù)篩后，獲得了一株高

2、產(chǎn)MK的突變菌株BS-53，其產(chǎn)量較原始菌株BS-5提高了90.5%，達(dá)到19.85mg/L，是原始菌株的1.9倍。經(jīng)25次傳代實(shí)驗(yàn)后，表明菌株BS-53產(chǎn)MK的能力具有遺傳穩(wěn)定性，BS-53菌株搖瓶液體發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為：甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉0.6g/L、，K2HPO40.3mol/L、CaCl2·2H2O0.1g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L。
　　(2)對(duì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響原生質(zhì)體形成率和再生率的各種因素進(jìn)行

3、研究。結(jié)果表明酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值、滲透壓穩(wěn)定劑、青霉素預(yù)處理、同步培養(yǎng)等對(duì)原生質(zhì)體形成和再生有較大影響，在對(duì)每個(gè)因素做單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了誘變菌株BS-53原生質(zhì)體形成和再生的最優(yōu)條件是：4℃保溫2h同步培養(yǎng)，0.6U/ml的青霉素預(yù)處理2h，離心收集菌體后置于pH為7.5的甘露醇溶液，加入1.4mg/ml的溶菌酶37℃酶解40min，此條件下原生質(zhì)體制備率為97.6%，再生率為26.3%。菌株CICC10262的

4、最優(yōu)條件是：4℃同步培養(yǎng)2h，2.0U/ml的青霉素預(yù)處理2h，離心收集菌體后置于pH為7.5的甘露醇溶液，加入1.0mg/ml的溶菌酶37℃酶解60min，原生質(zhì)體制備率為98.3%，再生率為24.3%。
　　(3)實(shí)驗(yàn)采用雙親滅活原生質(zhì)體電融合選育MK高產(chǎn)菌株，探究了滅活和電融合條件。結(jié)果表明：親本菌株經(jīng)熱滅活和紫外滅活后，在成串脈沖頻率2MHz，成串電壓32V，脈沖融合電壓500V，脈沖寬度40μs，脈沖個(gè)數(shù)6個(gè)的條件下進(jìn)行

5、電融合，篩選得到一株優(yōu)良菌株BKU-6，其MK的產(chǎn)量達(dá)到25.56mg/L，遠(yuǎn)高于產(chǎn)量低的親本菌株CICC10262。
　　(4)利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了MK生物合成相關(guān)基因menD、menB、menA在高產(chǎn)菌株BKU-6和原始菌株BS-53表達(dá)豐度的變化，分析了這些基因表達(dá)水平與MK產(chǎn)量提高的相關(guān)性。結(jié)果表明MK生物合成相關(guān)基因menD在高產(chǎn)菌株的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中始終保持高豐度表達(dá)，而原始菌株總體表達(dá)水平處于持續(xù)低迷狀態(tài)，隨著發(fā)

6、酵時(shí)間的增加表達(dá)量有所增加，但變化不明顯。因此menD基因的持續(xù)高表達(dá)與菌株的MK產(chǎn)量提高密切相關(guān)。MK生物合成基因menB在兩個(gè)菌株的發(fā)酵過(guò)程中表達(dá)豐度變化與menD基因的表達(dá)變化類(lèi)似，menB基因與MK的產(chǎn)量增加有一定的相關(guān)性，融合后菌株MK產(chǎn)量的提高與menB基因表達(dá)量呈正相對(duì)應(yīng)。對(duì)于MK生物合成中的menA基因，高產(chǎn)菌株在不同時(shí)間段的表達(dá)量處于相對(duì)較低的水平，與原始菌株相比，表達(dá)量并沒(méi)有顯著增加的現(xiàn)象。因此，menA基因與MK產(chǎn)