賴型鉤端螺旋體致病相關基因invA的克隆、表達及其功能研究.pdf

1、鉤體為廣泛流行的人獸共患病—鉤體病的病原體。目前，對鉤體的致病及免疫分子機理的認識不甚清楚。賴型鉤體56601株及哥本哈根株基因組測序表明，約60％的鉤體預測基因的功能未知。因此，鉤體的重要致病及免疫相關基因功能急需加強研究。 InvA基因存在于致病的賴型鉤體56601株及哥本哈根株中，信息分析表明，該基因與巴爾通體內的與編碼侵襲能力相關蛋白IalA的基因等具有很高的相似性；以PCR擴增試驗也證實，invA基因存在于強毒賴型鉤體

2、017株中，但不存在于無毒鉤體PatocⅠ株中。提示invA基因很可能為致病相關基因，同時，也很可能是一個免疫侯選基因及用于鉤體診斷的目的基因。 本研究選擇賴型鉤體017株中invA基因為目標，PCR擴增出含完整讀碼框的invA基因，與原核表達載體pET32a(+)連接構建重組表達載體pETINVA，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達出分子量約為35kDa的InvA融合蛋白。InvA融合蛋白在菌體內主要以可溶性方式表達，表達率約

3、占菌體總蛋白的50％。經(jīng)親和層析純化，獲得高純度的InvA融合蛋白。 進一步探討InvA融合蛋白的致病及免疫功能。實驗中制備了抗InvA融合蛋白抗體。按200μg/kg量免疫新西蘭兔三次，ELISA法檢測血中抗體滴度達到1：32000，收集兔血清并以辛酸-硫酸銨法純化，獲得兔抗InvA融合蛋白抗體。WesternBlotting檢測抗體的反應性，將純化的InvA融合蛋白、含pETINVA及pET32a(+)表達菌體蛋白電泳，轉印

4、至PVDF膜，以稀釋為1：10000兔抗InvA融合蛋白抗體為一抗，羊抗兔IgG為二抗，顯色結果表明呈現(xiàn)與InvA融合蛋白反應的特異條帶，表明該抗體特異性好。但InvA融合蛋白無刺激ANA-1細胞分泌IFN-γ的效應，認為InvA融合蛋白無細胞免疫的作用。 InvA蛋白的體內、外功能作了較全面的研究。以InvA融合蛋白作用于ANA-1，SPC-A-1，A549和ECV304細胞，觀察該蛋白的細胞增殖效應。結果顯示，InvA融合蛋

5、白有促進ANA-1細胞增殖效應，且該效應隨著InvA融合蛋白濃度升高及作用時間的延長增殖作用越明顯。但InvA融合蛋白對SPC-A-1，A549和ECV304細胞未產生明顯的促進或抑制增殖效應。 在進行的細菌侵襲試驗中，將含pETINVA或pET32a(+)表達菌BL21(DE3)與人紅細胞作用，結果表明含pETINVA菌比pET32a(+)表達菌侵入紅細胞內的數(shù)目顯著增多，說明InvA蛋白有助于細菌的侵襲。另外，構建了大腸桿菌

6、-鉤體PatocⅠ株重組穿梭質粒pGKINVA，電穿孔進入鉤體PatocⅠ株中，篩選出含pGKINVA的重組鉤體菌株，將有利于深入探索該蛋白的致病功能。 本研究成功克隆了鉤體的invA基因，構建pETINVA原核表達載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達了分子量約為35KDa的InvA融合蛋白，并純化出該蛋白。觀察到該蛋白促進ANA-1細胞的增殖效應，在表達菌BL21(DE3)中能顯著增強其細胞侵襲能力。制備的特異性抗InvA