CXCL12-CXCR4軸對食管癌預(yù)后的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、第一章CXCL12/CXCR4軸在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系 目的：新近研究顯示CXCL12/CXCR4軸在多種腫瘤組織中有表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲特性相關(guān)；本研究旨在檢測CXCL12及其受體CXCR4在食管鱗癌中的表達(dá)，研究兩者對食管鱗癌預(yù)后的影響及其與臨床及病理因素之間的關(guān)系。 方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測186例食管鱗癌組織標(biāo)本及20例正常食管上皮組織標(biāo)本中CXCR4、CXCL12蛋白的表達(dá)情況，C

2、XCR4、CXCL12表達(dá)陽性組與陰性組生存分析用Kaplan-Meier法，組間比較用log-rank檢驗，多因數(shù)分析采用Cox回歸多因數(shù)模型，CXCR4和CXCL12在食管鱗癌組織中表達(dá)與各臨床、病理因數(shù)的相關(guān)性采用x2檢驗。 結(jié)果： 1)CXCR4、CXCL12蛋白在食管鱗癌組織及正常食管上皮組織中的表達(dá) CXCR4蛋白在食管鱗癌組織細(xì)胞中陽性表達(dá)呈點(diǎn)狀，主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，經(jīng)免疫組化染色后呈棕黃色，

3、表達(dá)率為67.2％；CXCL12蛋白在食管鱗癌組織細(xì)胞中陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，呈淺棕色顆粒狀，表達(dá)率為63.4％。CXCR4及CXCL12蛋白在20例正常食管上皮組織中均無表達(dá)。 2)CXCL12、CXCR4及多個臨床、病理等因素的食管鱗癌預(yù)后多因素分析 將血型(分為B型與非B型組)、病理組織分化(分為高分化組與中低分化組)、PTNM分期(分為Ⅱ期組與Ⅲ期組)、年齡(分為<60歲組與≥60歲組)、腫瘤長度(分

4、為<5cm組與≥5cm組)、腫瘤位置(分為胸上段組、胸中段組和胸下段組)、切緣情況(分為切緣陽性組和切緣陰性組)、術(shù)后輔助治療(分為術(shù)后放化療組和無放化療組)、CXCR4(分為表達(dá)陽性組和陰性組)及CXCL12(分為表達(dá)陽性組和陰性組)等因數(shù)引入COX模型進(jìn)行多因數(shù)分析，結(jié)果顯示：PTNM分期(P=0.000)及CXCR4的表達(dá)(P=0.001)是影響食管鱗癌根治術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立因數(shù)。 3)生存分析 本組病例總的5年生

5、存率為19.9％。Kaplan—Meier生存分析顯示CXCL12陽性組與陰性組5年生存率分別為18.8％及21.0％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.6141)，CXCR4陽性組與陰性組5年生存率分別為2.2％及28.5％，差異具有顯著性差異(P=0.0003)。 4)CXCR4及CXCL12表達(dá)與各臨床病理特征的關(guān)系 CXCR4的表達(dá)與T分期(r=0.226)及N分期(r=0.477)呈正相關(guān)(p<0.05)，與CXCL1

6、2的表達(dá)無關(guān)(P=0.582)。 結(jié)論： 1、CXCL12/CXCR4軸在食管鱗癌組織中有較高的表達(dá)，在正常組織無表達(dá)； 2、CXCR4的表達(dá)水平與食管腫瘤的發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系； 3、CXCR4的表達(dá)與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤局部浸潤有關(guān)； 4、CXCR4與CXCL12在食管鱗癌的表達(dá)無相關(guān)性。 第二章慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706、ECA109的表達(dá)

7、 目的：探討運(yùn)用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109細(xì)胞表達(dá)的可行性。 方法：1)運(yùn)用QPCR檢測CXCR4在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109的mRNA表達(dá)；2)運(yùn)用細(xì)胞免疫化學(xué)法及免疫印跡法(Western—blot法)檢測CXCR4、CXCL12在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109的蛋白表達(dá)；3)運(yùn)用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4基因在食管鱗癌細(xì)胞株E

8、C9706及ECA109細(xì)胞的表達(dá)；4)QPCR及Western—blot法檢測CXCR4靜默后，CXCR4在EC9706及ECA109的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1)CXCL12及CXCR4在食管癌細(xì)胞株EC9706和ECA109均有表達(dá)。 2)慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4后，細(xì)胞株EC9706及ECA109靜默組CXCR4表達(dá)較控制組及陰性對照組弱。 結(jié)論：慢病毒載體介導(dǎo)shRNA可以高效、特異地

9、靜默CXCR4在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109的表達(dá)。 第三章CXCL12/CXCR4軸對食管鱗癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響 目的：研究CXCL12/CXCR4軸對食管鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖及凋亡的影響，分析其作用機(jī)制。 方法：1)MTT法檢測不同濃度CXCL12對兩種食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109生長的影響，以及靜默CXCR4后對食管鱗癌細(xì)胞生長的影響。2)流式細(xì)胞儀檢測CXCL12及靜默CXCR4

10、后對食管鱗癌EC9706、ECA109細(xì)胞株細(xì)胞周期和凋亡的影響。3)Western—blot法檢測靜默CXCR4前后，Bcl—2在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109表達(dá)的變化。4)通過裸鼠體內(nèi)實驗，檢測CXCL12/CXCR4軸對食管癌細(xì)胞株EC9706及ECA109生物學(xué)行為的影響。 結(jié)果： 1)CXCL12促進(jìn)EC9706及ECA109的增殖能力，25ng/ml為最小有效濃度(P<0.05)。 2)應(yīng)

11、用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4在食管鱗癌細(xì)胞株EC9706及ECA109的表達(dá)后，靜默組細(xì)胞生長能力較控制組及陰性對照組弱(P<0.05)，陰性對照組與控制組間則無明顯差異(P>0.05)。 3)靜默組較控制組及陰性對照組，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，S期細(xì)胞則減少，細(xì)胞凋亡率上升(P<0.05)。 4)靜默CXCR4后，在EC9706及ECA109細(xì)胞株中，靜默組Bcl—2蛋白表達(dá)較控制組及陰性對照組減弱。

12、 結(jié)論： 1)CXCL12可促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞生長，降低凋亡率。 2)運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4可有效地抑制食管鱗癌細(xì)胞生長，提高凋亡率。 3)靜默CXCR4后，Bcl—2蛋白表達(dá)下調(diào)可能是導(dǎo)致食管癌細(xì)胞凋亡率升高的機(jī)制之一。 第四章CXCL12/CXCR4軸對食管鱗癌細(xì)胞株侵襲、運(yùn)動、粘附的影響 目的：觀察CXCL12/CXCR4軸對體外培養(yǎng)的食管鱗癌細(xì)胞侵襲、運(yùn)動、粘附能力的影響

13、。探討CXCL12/CXCR4軸在食管鱗癌轉(zhuǎn)移過程中所起的作用，運(yùn)用慢病毒載體介導(dǎo)shRNA靜默CXCR4，抑制食管鱗癌轉(zhuǎn)移傾向的可能性。 方法：通過侵襲實驗、劃痕實驗、粘附實驗分別檢測CXCL12/CXCR4軸對食管鱗癌細(xì)胞株EC9706、ECA109細(xì)胞侵襲、移動、粘附能力的影響。 結(jié)果： 1)CXCL12誘導(dǎo)EC9706、ECA109細(xì)胞穿過仿人基地膜，呈劑量依賴性，CXCL12濃度為50ng/ml時誘導(dǎo)效

14、果明顯。 2)在相同濃度CXCL12(200ng/ml)誘導(dǎo)下，EC9706及ECA109細(xì)胞的靜默組與控制組及陰性對照組比較，穿透仿人基底膜細(xì)胞數(shù)明顯減少(p=0.000)。 3)EC9706、ECA109細(xì)胞5天爬滿六孔板，EC9706及ECA109陰性對照組與控制組所需時間相同；EC9706及ECA109靜默組所需時間較控制組及陰性對照組長，需6天；兩細(xì)胞株SDF-1α組所需時間較控制組、陰性對照組及靜默組短，需4

15、天。 4)EC9706及ECA109細(xì)胞株的控制組及陰性對照組對BME膠粘附能力無明顯差別(P>0.05)；EC9706及ECA109細(xì)胞株的靜默組對BME膠粘附能力較控制組及陰性對照組下降(P<0.05)；加入SDF-1α處理的EC9706及ECA109細(xì)胞株對BME膠粘附能力較無處理組的細(xì)胞株加強(qiáng)(P<0.05)。 結(jié)論： 1)CXCL12可增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞株細(xì)胞EC9706及ECA109的移動、粘附、侵襲能