豬源腸毒素大腸桿菌K88ac和F18ac菌毛蛋白基因的表達(dá)及其在卵黃抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用.pdf

1、腸毒素大腸桿菌(ETEC)是引起新生仔豬和斷奶仔豬腹瀉的主要致病性大腸桿菌。本研究建立了豬源腸毒素大腸桿菌常見的菌毛基因型K88、K99、987P、F41和F18及其亞型的PCR分型檢測方法,調(diào)查了湖北省內(nèi)規(guī)?；i場進(jìn)行了ETEC菌毛基因型的分布特征,確定了K88和F18是引起斷奶仔豬腹瀉的ETEC兩種最常見菌毛蛋白基因型。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)K88ac菌毛亞單位基因faeG和F18ac菌毛亞單位基因fedF的融合基因faeG-l

2、inker-fedF的重組質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)了faeG和融合基因faeG-linker-fedF在大腸桿菌中的表達(dá),并探討了重組的菌毛蛋白的免疫原性及其誘導(dǎo)產(chǎn)生卵黃抗體的作用,通過體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)評(píng)價(jià)由重組菌毛蛋白免疫制備的卵黃抗體在預(yù)防和控制斷奶仔豬腹瀉的潛在應(yīng)用價(jià)值,進(jìn)一步研究了卵黃抗體在斷奶仔豬日糧中應(yīng)用。結(jié)果如下:
　　 1.以ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株為試驗(yàn)材料,建立了ETECK88、K99、987P、F41、F18及其變異體的PCR

3、鑒定方法,并對(duì)湖北省部分地區(qū)規(guī)模化萬頭豬場進(jìn)行了ETEC流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明:通過設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的目的片段。對(duì)2002-2003年來源于新生仔豬和斷奶仔豬的227份腹瀉糞樣進(jìn)行了K88及其變異體和K99的PCR檢測,結(jié)果顯示,23份(10.1％)被確定為含有ETECK88,其變異體均為K88ac；13份含有K99(5.7％)。對(duì)2004年179份來源于1d至6w仔豬的腹瀉糞樣進(jìn)行了ETECK88、K99、987P、

4、F41、F18及其變異體的PCR檢測,共有60份(33.52％)含有ETEC菌毛基因型的一種或幾種。其中,36份含有K88菌,占60.00％,是最主要的一種菌毛基因型；K88進(jìn)一步的分型鑒定結(jié)果則顯示,4份檢出為K88ac(11.11％),32份為K88ad(88.89％),未檢測出K88ab。含F(xiàn)18的樣品數(shù)有16份,占26.67％:進(jìn)一步的分型結(jié)果顯示F18ab5份(8.33％),F18ac11份(18.34％)。另外,含K99菌的

5、有2份(3.33％),987P有11份(18.33％),F41有3份(5.00％)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,PCR方法鑒定ETEC具有快速、特異性強(qiáng)、敏感性和準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn),適合于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查；K88和F18是湖北地區(qū)新生仔豬和斷奶腹瀉糞樣中最常見的兩類菌毛基因型。
　　 2.通過PCR擴(kuò)增技術(shù),用疏水性連接肽(Gly4Ser)3序列連接faeG和fedF兩基因片段,構(gòu)成融合基因faeG-linker-fedF,并分別構(gòu)建fae

6、G和faeG-linker-fedF的重組表達(dá)質(zhì)粒。測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒中目的片段的DNA序列正確,將該重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入E.ColiDH5a和BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果faeG和faeG-linker-fedF在大腸桿菌中均獲得高效表達(dá),它在BL21(DE3)中的表達(dá)量均占總蛋白含量的30％左右,表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在。
　　 3.采用響應(yīng)面分析方法,對(duì)腸毒素大腸桿菌K88黏附素亞單位重組蛋白FaeG誘導(dǎo)表達(dá)的主要影

7、響因素進(jìn)行了優(yōu)化研究。響應(yīng)面分析結(jié)果表明:不同的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量均有顯著影響(P＜0.01),而三因素之間的交互作用對(duì)目的蛋白表達(dá)量也有極顯著的影響(P＜0.01)。通過進(jìn)一步的模擬優(yōu)化,得到了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為:培養(yǎng)BL21(K88ac)重組菌株2.5h后,加入IPTG至終濃度0.8mmol/L,37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。采用以上參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到目的蛋白在全菌蛋白中的表達(dá)含量為35.4％；與單次單因子法

8、得到的最佳表達(dá)條件下的表達(dá)量(27.5％)相比,提高了28.7個(gè)百分點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,采用響應(yīng)面分析法可以確定IPTG的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等多個(gè)因素對(duì)重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的最佳作用條件,有利于提高目的蛋白的表達(dá)量。
　　 4.應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測重組蛋白rFaeG和FaeG-FedF的免疫原性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rFaeG和FaeG-FedF均能夠與兔抗K88ac陽性血清抗體發(fā)生特異性抗原抗體結(jié)合反應(yīng),FaeG-FedF還

9、能夠與F18“a”因子血清發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng),這表明重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF具有與天然菌毛蛋白相同或相似的抗原性。將重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫蛋雞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白均能刺激蛋雞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng),并誘導(dǎo)卵黃抗體產(chǎn)生,在二免1周卵黃中的抗體水平便明顯升高,平均效價(jià)可達(dá)1:210以上,且此抗體水平可以維持較長一段時(shí)間。因此,重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF可以作為卵黃抗體生產(chǎn)

10、的候選免疫原。
　　 5.用分離提純的K88ac菌毛蛋白、重組蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF免疫28周齡左右海蘭褐開產(chǎn)蛋雞,并收集雞蛋將其噴霧干燥成粉,分別為Anti-K88acSDEP,Anti-rFaeGSDEP和Anti-FaeG-FedFSDEP。利用體外試驗(yàn)研究了重組蛋白rFaeG和FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體抑制細(xì)菌黏附作用,結(jié)果顯示:無抗體的對(duì)照組平均每個(gè)上皮細(xì)胞黏附7.6個(gè)K88ac；由提純蛋

11、白免疫獲得的Anti-K88acSDEP以及Anti-rFaeGSDEP和Anti-FaeG-FedFSDEP較對(duì)照組均極顯著抑制了K88ac對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用,平均每個(gè)上皮細(xì)胞分別僅黏附1.0、1.2和1.0個(gè)細(xì)菌(P＜0.01)。3種卵黃抗體粉對(duì)細(xì)菌黏附腸上皮細(xì)胞均具有顯著抑制作用,且三者的作用效果無明顯差異(P＞0.05)。此外,與F18ac對(duì)照組相比,經(jīng)Anti-FaeG-FedFSDEP處理后的F18ac黏附于腸上皮細(xì)胞上

12、的數(shù)量極顯著減少(P＜0.01)；同樣經(jīng)Anti-FaeG-FedFSDEP處理后的F18ab對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附也明顯低于F18ab對(duì)照組(P＜0.01)。由此表明,由重組菌毛蛋白rFaeG和Fae-FedF制備的卵黃抗體均可以有效抑制K88ac對(duì)仔豬腸上皮細(xì)胞的黏附；此外,具備兩種菌毛基因型的融合蛋白FaeG-FedF免疫獲得的卵黃抗體,不僅可以抑制同源菌株F18ac的黏附作用,還可以阻斷異源菌株F18ab對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附。