K88ac+大腸桿菌減毒株的構(gòu)建及其在小鼠體內(nèi)的初步應(yīng)用.pdf

1、仔豬腹瀉是造成全球范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)損失的重要原因之一，導(dǎo)致該病發(fā)生的主要病原微生物是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)，其毒力因子主要包括粘附素和腸毒素。粘附素又稱為定居因子，是致病性大腸桿菌在腸道內(nèi)定居繁殖的首要條件，而腸毒素是產(chǎn)毒素大腸桿菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中釋放的外毒素，能導(dǎo)致水和電解質(zhì)流向腸腔，造成機(jī)體腹瀉，ETEC腸毒素分為耐熱性腸毒素(heat-stable entero

2、xin，ST)和不耐熱性腸毒素(heat-labile enteroxin，LT)兩類。本研究選取了表達(dá)K88ac菌毛，并能分泌LT和ST2腸毒素的的大腸桿菌K88ac+ ETEC(C83902)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了LT毒力基因的點(diǎn)突變以及ST2毒力基因的敲除，成功構(gòu)建了減毒ETEC，并在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了初步應(yīng)用，取得較好的效果，主要過(guò)程如下。
　　利用Red同源重組無(wú)痕敲除技術(shù)對(duì)K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生株的LT基因進(jìn)行點(diǎn)

3、突變。根據(jù)已發(fā)表的LT基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用Red同源重組的方法對(duì)LT的A亞單位基因進(jìn)行無(wú)痕點(diǎn)突變，將A亞單位第63位編碼Ser的密碼子(TCT)突變?yōu)榫幋aLys的密碼子(AAA)，獲得突變菌株K88ac+ ETEC LT(S63K)。再利用Red同源重組敲除技術(shù)，將K88ac+ ETEC LT(S63K)菌株的ST2基因敲除，替代為兩端攜帶dif位點(diǎn)的Gm抗性基因，利用細(xì)菌自身Xer酶切除Gm抗性基因，測(cè)序鑒定正確后，將其命名為

4、K88ac+ ETECLT(S63K)ΔST2。通過(guò)進(jìn)行兔體回腸結(jié)扎實(shí)驗(yàn)對(duì)K88ac+ ETEC LT(S63K)ΔST2的腸毒素進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)立K88ac+ ETEC(C83902)、DH5α以及CAYE對(duì)照組，結(jié)果顯示注射K88ac+ETEC LT(S63K)ΔST2、DH5α無(wú)菌培養(yǎng)上清以及CAYE培養(yǎng)基的腸段積液體積與腸段長(zhǎng)度比值均小于等于0.9，而注射K88ac+ETEC(C83902)無(wú)菌培養(yǎng)上清的腸段積液體積與腸段長(zhǎng)度比值

5、為1.27，表明K88ac+ ETEC LT(S63K)ΔST2的確是一株腸毒素減毒的大腸桿菌。
　　將8周齡大小的清潔級(jí)Balb/c小鼠頸椎脫臼處死后，采集小鼠的回腸，切割成大小5mm長(zhǎng)的腸段，剪開(kāi)腸管，無(wú)菌的PBS中洗滌3遍后，浸泡到K88ac+ ETEC(C83902)、K88ac+ETEC LT(S63K)ΔST2和DH5α菌液及無(wú)菌PBS中，37℃孵育1h，刮取回腸黏膜，涂布載玻片，美蘭染色后顯微鏡下觀察細(xì)菌，結(jié)果K88

6、ac+ ETEC(C83902)、K88ac+ ETECLT(S63K)ΔST2菌液浸泡的腸黏膜刮取液中可觀察到菌體，而DH5α菌液和PBS液浸泡的腸黏膜刮取液中無(wú)可見(jiàn)的菌體;將109 cfu的K88ac+ ETEC LT(S63K)ΔST2給小鼠灌胃，同時(shí)設(shè)立產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88ac+ ETEC(C83902)對(duì)照組，結(jié)果致弱K88ac+大腸桿菌接種的小鼠無(wú)任何臨床癥狀，K88ac+ ETEC(C83902)接種小鼠后，小鼠出現(xiàn)顫抖

7、、食欲廢絕、死亡等癥狀，剖檢后腸道內(nèi)有大量黃色積液，腸壁發(fā)生粘連。表明在K88ac菌毛的作用下，大腸桿菌能粘附到小鼠的回腸黏膜表面，分泌腸毒素的K88ac+ ETEC可使Balb/c小鼠發(fā)病死亡，而致弱的K88ac+ ETEC LT(S63K)ΔST2由于腸毒素基因點(diǎn)突變及缺失，即使大劑量的灌胃，對(duì)小鼠也無(wú)明顯影響。
　　將K88ac+ ETEC LT(S63K)ΔST2灌胃Balb/c小鼠，分別于隨后的24h、48h、72h、9