豬源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K88、K99，987P、F41雙基因串聯(lián)表達(dá)的研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原菌，黏附素在ETEC的致病過程中起著重要作用。從動物ETEC中發(fā)現(xiàn)的粘附素抗原有K88、K99、987P、F41、F42、F165、F17和F18等。而豬源粘附素抗原則以K88、K99、987P、F41最為常見。本研究實(shí)現(xiàn)了上述四種常見黏附素抗原的克隆表達(dá)，并在此基礎(chǔ)上對K88-K99、987P-F41進(jìn)行了串聯(lián)表達(dá)。對表達(dá)蛋白進(jìn)行了western-blot鑒定及反向間接血凝試驗(yàn)，結(jié)

2、果表明所表達(dá)的融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性和免疫活性。為基因工程二價(jià)苗及多價(jià)苗的研制奠定了基礎(chǔ)。研究內(nèi)容如下： 1.利用PCR技術(shù)，以大腸桿菌C83907、C83644、C83710的質(zhì)粒和C83707的基因組DNA為模板分別擴(kuò)增不含信號肽的K88、K99、987P和F41基因。將其分別克隆到pMD18-t載體上，酶切鑒定成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-K88、pMD18-K99、pMD18-987P、pMD18-F41。將其與pET

3、30a載體分別經(jīng)雙酶切，將回收的基因小片段與載體大片段連接，得到的四種重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切及PCR鑒定，并進(jìn)行核苷酸序列分析，陽性質(zhì)粒命名為pETK88、pETK99、pET987P、pETF41。將此四種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，目的基因得到高效表達(dá)。 2.在成功克隆K99基因的基礎(chǔ)上，通過引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)-對引物使擴(kuò)增出的K88基因不含終止密碼子。利用DNA重組技術(shù)將此K8

4、8基因亞克隆于pET30a表達(dá)載體中，得到陽性重組質(zhì)粒命名為pETK88-2。進(jìn)一步將K99基因融合到K88-2基因的下游，構(gòu)建K88-K99串聯(lián)基因，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌BL21中的高效表達(dá)。同時(shí)，對于F41-987P雙基因串聯(lián)表達(dá)，基本實(shí)驗(yàn)方法同K88-K99。區(qū)別在于，首先PCR擴(kuò)增不含終止密碼子的987P基因，將其克隆于pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pMD18-987P-2。將987P-2基因插入到pETF41重組質(zhì)粒

5、的F41基因的上游。構(gòu)建987P-F41串聯(lián)基因，并實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達(dá)。 3.Western-blotting檢測，結(jié)果表明，K88-K99、F41-987P串聯(lián)表達(dá)蛋白能被大腸桿菌K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)血清及F41抗血清識別。具有良好的反應(yīng)原性。反向間接血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，K88效價(jià)為28～210，K99效價(jià)為27～28，F(xiàn)41效價(jià)為26～28，987P效價(jià)為28～210，該串聯(lián)表達(dá)蛋白具有良好的抗原性。表明構(gòu)建的重