大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化的體外研究.pdf

1、各種原因?qū)е玛幍廊笔У幕颊咝枰M(jìn)行陰道成形術(shù)，傳統(tǒng)手術(shù)存在著犧牲正常組織、遺留瘢痕、免疫排斥等問題。組織工程技術(shù)為陰道重建提供理想的組織襯里，并且重建的陰道有理想的深度和寬度，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)手術(shù)形成的人工陰道在形態(tài)和功能上的不足。種子細(xì)胞是進(jìn)行組織工程化組織構(gòu)建的最為關(guān)鍵的要素，只有獲得足夠數(shù)量并保持特定生物學(xué)活性的種子細(xì)胞，才能保證組織構(gòu)建的成功。目前陰道組織工程的種子細(xì)胞大都采用自體組織的同源細(xì)胞，但是存在著來源有限、細(xì)胞易老化、不能大

2、規(guī)模擴(kuò)增以及細(xì)胞取材對機(jī)體造成新的創(chuàng)傷等不足，因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)向上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化是其在陰道組織工程中應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。本研究嘗試應(yīng)用大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化，為BMSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用于陰道組織工程奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分，原代培養(yǎng)大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞的研究
　　 目的:探討大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞體外

3、培養(yǎng)方法，以應(yīng)用于誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的研究。
　　 方法:取大鼠口腔黏膜組織，分別用PBS配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ，D-KSFM配制的0.6U/ml的DispaseⅡ和D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ，記錄每組上皮分離結(jié)果的評分及可獲活細(xì)胞數(shù)，倒置相差顯微鏡下觀察首次換液時(shí)細(xì)胞貼壁情況;分別用胰酶消化10min×二次和20min×一次方

4、法，用KBM-GOLD培養(yǎng)基和含6％FBS的KBM-GOLD培養(yǎng)基培養(yǎng)，記錄每組上皮可獲活細(xì)胞數(shù)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，掃描電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，免疫組化及免疫熒光鑒定。
　　 結(jié)果:PBS配制組與D-KSFM配制組相比，兩者分離結(jié)果評分基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=1.0＞0.05），可獲活細(xì)胞數(shù)小于D-KSFM配制組，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05），首次換液時(shí)可見D-KSFM配制組貼壁細(xì)胞較多;1.2U/ml組與0.6

5、U/ml組相比，上皮層更易完整分離，分離結(jié)果評分及可獲活細(xì)胞數(shù)更高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025＜0.05;P=0.036＜0.05);胰酶消化10min×二次組可獲活細(xì)胞數(shù)高于20min×一次組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.388)，首次換液時(shí)倒置顯微鏡下觀察胰酶多次消化組貼壁細(xì)胞更多;大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞在KBM-GOLD培養(yǎng)基中48h可見成簇貼壁細(xì)胞，3-6天細(xì)胞稍增多，7-8天逐漸融合，呈鋪路石樣外觀，在含6％FBS的KBM-GO

6、LD培養(yǎng)基中生長快，4-6天可達(dá)約85％融合，但夾有長梭形的成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。倒置顯微鏡下見上皮細(xì)胞呈不規(guī)則圓形或多邊形，連接成片后似鋪路石狀。掃描電鏡下細(xì)胞表面可見微絨毛嵴。廣譜角蛋白AE1/AE3免疫組化染色為陽性，免疫熒光示胞漿紅色。
　　 結(jié)論:依次使用D-KSFM配制的1.2U/ml的DispaseⅡ和胰酶消化10min×二次，在KBM-GOLD培養(yǎng)基中可獲得更多的口腔黏膜上皮細(xì)胞，并顯示上皮細(xì)胞特征。

7、
　　 第二部分，體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化的研究
　　 目的:探討大鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞體外誘導(dǎo)BMSCs向上皮細(xì)胞分化的培養(yǎng)方法，為BMSCs作為種子細(xì)胞應(yīng)用于陰道組織工程提供依據(jù)。
　　 方法:取大鼠口腔黏膜組織，用DispaseⅡ和胰酶分步消化，獲取上皮細(xì)胞，接種于Transwellinsert小室，取第三代至第五代生長良好BMSCs以3×103/cm2（共培養(yǎng)14天）和5×103/cm2（

8、共培養(yǎng)7天）接種于六孔板，靜置培養(yǎng)貼壁后，與在Transwellinsert小室中培養(yǎng)2天的大鼠口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，加入含3％FBS的KBM-GOLD培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，共培養(yǎng)14天的transwellinsert小室在第8天時(shí)更換一次。每天在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化，分別在共培養(yǎng)的第7、14天，通過免疫組織化學(xué)和westernblot鑒定上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物廣譜角蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:誘導(dǎo)初期細(xì)胞成長條梭型，大小均一，無明

9、顯突起，當(dāng)共培養(yǎng)第7天時(shí)，少量細(xì)胞變成圓形或橢圓形，周圍有短的絨毛樣突起，核呈圓形或橢圓形，胞漿豐富，AE1/AE3染色后部分細(xì)胞為陽性，胞漿呈棕黃色顆粒;誘導(dǎo)培養(yǎng)14天時(shí)，圓形或橢圓形細(xì)胞明顯增多，AE1/AE3陽性表達(dá)細(xì)胞明顯增多，并且細(xì)胞排列方式發(fā)生了變化，誘導(dǎo)后的細(xì)胞排列不規(guī)則或聚集成團(tuán)。westernblot結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的細(xì)胞有廣譜角蛋白表達(dá)，并且14天時(shí)表達(dá)水平比7天明顯增加。
　　 結(jié)論:體外大鼠口腔上皮細(xì)胞與B