EGF-R、IGF-1-R在胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化為上皮細胞中的作用.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）具有多向分化潛能。課題組已有實驗表明在加入EGF、IGF-1等生長因子的條件培養(yǎng)基誘導下BMSCs能表達CK，向上皮分化。但BMSCs何時表達EGF-R和IGF-1-R以及該受體與細胞分化為上皮細胞的關系尚未見相關報道。本實驗擬測定BMSCs EGF-R和IGF-1-R的表達時間；在加入EGF或IGF-1誘導后BMSC

2、s表達EGF-R、IGF-1-R和CK的變化；以及加入受體阻斷劑后培養(yǎng)的BMSCs是否還能分化為上皮細胞。擬通過本實驗研究EGF、IGF-1誘導BMSCs分化的機制，為BMSCs在細胞移植治療以及組織工程研究提供理論依據(jù)和實驗方法。 第一部分胎兒BMSCs表達EGF受體和IGF受體及體外誘導分化 1.收集3～5個月胎齡引產(chǎn)胎兒四肢骨骨髓，分離、培養(yǎng)、擴增獲得BMSCs。比較11～13周的標本和20～24周標本獲得的BMS

3、Cs的生長特點。結果：13周以內(nèi)標本獲得的細胞擴增到P4時，數(shù)量多于20～24周標本；首次傳代時間早，衰老出現(xiàn)時間晚。 2.檢測BMSCs EGR-R和IGF-1R出現(xiàn)時間。從P3開始，用免疫組織化學染色法每天檢測EGF-R、IGF-1-R的表達。結果顯示：EGF-R首次表達為P4第4d～P5第3d；IGF-1-R首次表達為P5第2d～P6第2d。 3.分別用EGF30ng/mL，IGF-150 ng/mL，EGF30

4、ng/mL+IGF-150ng/mL誘導P3-BMSCs，設立無生長因子對照組，檢測EGF-R、IGF-1-R和CK的表達。結果：EGF和IGF-1誘導組細胞表達EGF-R和IGF-1-R較對照組提前2～4天；CK表達最早出現(xiàn)在P4誘導后2天，對照組P6第4d出現(xiàn)微弱的CK表達。 4.用抗EGF-R抗體2mg/mL或抗IGF-1-R抗體1.5mg/mL孵育P5-BMSCs4h后，分別加入含EGF30ng/mL、IGF-150ng

5、/mL的培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時另設4個對照組：EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30ng/M1+IGF-150ng/mL和空白對照組。檢測EGF-R、IGF-1-R和CK的表達。結果：EGF-R和IGF-1-R阻滯后，第4d可檢測到CK，但CK+細胞率和強度均低于加入生長因子誘導組（P<0.05），接近空白對照組。 第二部分羊膜體外誘導胎兒BMSCs的分化 1.取10例羊膜，用機械分離和氫氧化銨法去除上皮，

6、制成羊膜結締組織，光鏡觀察其表面無上皮細胞。 2.將3.0×105個DAPI標記的P4-BMSCs種植于羊膜上，分別用EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30 ng/mL+IGF-150 ng/mL聯(lián)合誘導，同時設無生長因子的羊膜對照組和生長因子誘導的細胞爬片對照組。各組誘導24～28d后，經(jīng)免疫熒光染色后，CLSM下見羊膜鋪片和切片上有DAPI藍色熒光標記核，同時胞質(zhì)中有CK綠色熒光的細胞，表明BMSCs已分

7、化為上皮細胞。 3.誘導培養(yǎng)第10d，各組BMSCs表達CK細胞率統(tǒng)計結果顯示：單用羊膜或者羊膜浸提液誘導BMSCs分化為上皮的能力強于對照組，P<0.05；羊膜與EGF、IGF-1聯(lián)合誘導作用強于單用羊膜組，P<0.05；終濃度30ng/mL EGF的誘導作用強于50ng/mL IGF-1，P<0.05。 4.TEM下見羊膜上種植的BMSCs與結締組織見未見基膜形成，細胞間未見細胞連接。 全文結論： 1

8、.13周以內(nèi)標本獲得的骨髓細胞首次傳代時間早，衰老出現(xiàn)時間晚；擴增到P4時，BMSCs數(shù)量多于20～24周標本。 2.P4-BMSCs開始表達EGF-R，P5-BMSCs開始表達IGF-1-R。提示此時是施加EGF、IGF-1等生長因子的合適時間。 3.EGF和IGF-1誘導后，EGF-R和IGF-1-R表達CK的時間早于對照組。表明EGF和IGF-1可促進BMSCs表達EGF-R和IGF-1-R，以及BMSCs向上皮細

9、胞分化。 4.P3-BMSCs的EGF-R和IGF-1-R阻滯后，其向上皮細胞分化的時間和數(shù)量均低于對照組，證明EGF-R和IGF-1-R可能參與了BMSCs向上皮細胞分化的調(diào)控。 5.BMSCs能在去上皮羊膜上生長，并分化為能表達CK的上皮細胞。去上皮羊膜，外源性EGF和IGF-1，以及羊膜結締組織浸提液在體外都能誘導BMSCs向上皮細胞分化，以羊膜與外源性EGF和IGF-1聯(lián)合誘導作用最強，EGF的誘導作用強于IGF