外源重組Wnt3a蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量及分泌活性影響的研究.pdf

1、奶牛的乳腺組織具有合成及分泌乳汁的特殊功能，而這一功能是由乳腺上皮細(xì)胞來完成的，上皮細(xì)胞的數(shù)量及其分泌活性直接影響到奶牛的產(chǎn)奶量。奶牛的乳腺組織具有重塑的功能，伴隨著泌乳周期周而復(fù)始的變化，不斷的進(jìn)行退化和重塑。如果在乳腺組織重塑的過程中，能夠使具有泌乳功能的上皮細(xì)胞的數(shù)量在有限的空間內(nèi)增加更多，活性更強(qiáng)，那么對(duì)乳產(chǎn)量具有重要的意義。有研究證明成年小鼠乳腺中含有對(duì)Wnt蛋白敏感的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群中含有豐富的乳腺干細(xì)胞，并證實(shí)了Wnt3

2、a蛋白對(duì)乳腺干細(xì)胞集落的形成有明顯的促進(jìn)作用，維持了其形成功能性腺體的功能。推測，Wnt通路的激活可以促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。
　　本實(shí)驗(yàn)以健康奶牛乳腺組織為原材料，組織塊培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織塊培養(yǎng)至3-4天有成纖維細(xì)胞長出，6天左右有鵝卵石樣和鋪路石樣上皮細(xì)胞長出，細(xì)胞核大而明顯，有2至4個(gè)核仁，細(xì)胞間隔緊密。
　　細(xì)胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白提取方法的改進(jìn)。因所培養(yǎng)的細(xì)胞為

3、原代單層貼壁細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量有限，故培養(yǎng)液中上皮細(xì)胞分泌物的量很少，不易檢測。本實(shí)驗(yàn)中采用了四種蛋白提取方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的β-酪蛋白進(jìn)行提取，并結(jié)合western-blot方法對(duì)提取液進(jìn)行鑒定，獲得了操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，切實(shí)可行的提取方法，即物理沉淀法。同時(shí)證明了所獲得的乳腺上皮細(xì)胞具有正常分泌功能。從而，初步建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系。
　　在組織塊培養(yǎng)48h進(jìn)行第一次換液時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度(10ng/mL、

4、25ng/mL和50ng/mL)的外源性重組Wnt3a蛋白。選取各組培養(yǎng)至7-11天的細(xì)胞（各兩個(gè)重復(fù)），用酶消化法純化細(xì)胞，所得細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。收集10-12天的細(xì)胞培養(yǎng)液，用Western-blot方法檢測培養(yǎng)至10-12天的細(xì)胞培養(yǎng)液中β-酪蛋白的分泌量。與此同時(shí)，待收集細(xì)胞培養(yǎng)液后，用酶消化法消化三次去除成纖維細(xì)胞，得到純化的上皮細(xì)胞，提取上皮細(xì)胞中總RNA，采用熒光定量PCR方法對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)

5、通路中Frizzled1受體和β-catenin的mRNA表達(dá)進(jìn)行了測定。三組中Frizzled1受體mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.79、1.13和1.89，β-catenin的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.44、0.91和1.19。
　　結(jié)論:初步建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，成功摸索出β-酪蛋白的提取方法;50ng/mL的Wnt3a為本實(shí)驗(yàn)中刺激乳腺上皮細(xì)胞的最適宜濃度，上皮細(xì)胞的數(shù)量和β-酪蛋白的分泌量明顯較高于其他各組