蛋氨酸、賴氨酸及其二肽對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α-,S1-基因表達(dá)的影響.pdf

1、本課題以泌乳奶牛乳腺組織為原材料，比較幾種不同收集乳腺上皮細(xì)胞的方法，從中選擇一種比較合適的方法，做為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，通過體外培養(yǎng)研究小肽和游離氨基酸以及賴氨酸和蛋氨酸比例對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α<,Sl>基因表達(dá)的影響。 1．乳腺上皮細(xì)胞收集方法的比較研究采用三種不同的方法(酶消化、機(jī)械分離、組織塊培養(yǎng))收集乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，三種不同的方法收集的乳腺細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7天，從第二天開始測(cè)MTTOD值，以此反映三

2、種方法收集的乳腺細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)增殖情況。 結(jié)果表明：膠原酶消化收集的乳腺上皮細(xì)胞在隨后的培養(yǎng)過程中活性很低，不能正常生長(zhǎng)和增殖。通過機(jī)械分離的方法分離乳腺組織時(shí)，分離得到的單個(gè)細(xì)胞相對(duì)較少，主要以細(xì)胞團(tuán)的形式分離出來，這些細(xì)胞團(tuán)形式存在的細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中不容易貼壁，懸浮在培養(yǎng)液當(dāng)中，導(dǎo)致其在隨后的培養(yǎng)過程中活性也很低。組織塊培養(yǎng)的方法收集的乳腺上皮細(xì)胞在培養(yǎng)過程能正常生長(zhǎng)與增殖，并且出現(xiàn)了“拉網(wǎng)”、“圓頂狀”等上皮

3、細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，收集的細(xì)胞在MTI細(xì)胞增殖試驗(yàn)中其OD值在培養(yǎng)5天后要顯著高于其它兩種方法收集得到的細(xì)胞(P<0.01)，而且OD值的曲線呈“S”形，符合細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的規(guī)律。 2．蛋氨酸和二肽對(duì)體外培養(yǎng)酪蛋白基因表達(dá)的影響采用組織塊培養(yǎng)的方法收集奶牛乳腺上皮細(xì)胞，通過添加不同濃度的蛋氨酸，等量的蛋氨酸與蛋氨酸二肽以及蛋氨酸、賴氨酸與蛋氨酸賴氨酸二肽之間的替換，研究其對(duì)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)的影響。蛋氨酸添

4、加水平為0、20、40、60、80和100μg/ml。結(jié)果表明：添加蛋氨酸的濃度低于60μg/ml時(shí)酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)隨蛋氨酸濃度的增加而增強(qiáng)，隨后酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)隨蛋氨酸濃度的增加而減弱，添加蛋氨酸為60μg/ml時(shí)基因表達(dá)最強(qiáng)，與0μg/ml組間差異顯著(P<0.05)，其余各組間差異均不顯著；用60μg/ml蛋氨酸二肽或120μg/ml蛋氨酸賴氨酸二肽替代等量的游離氨基酸時(shí)，添加二肽組乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α<,sl

5、>基因表達(dá)要極顯著高于添加游離氨基酸組(P<0.01)，同時(shí)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，添加小肽組培養(yǎng)液中酪蛋白的濃度高于添加相應(yīng)的游離氨基酸組。從上述結(jié)果可以說明乳腺上皮細(xì)胞可以利用蛋氨酸二肽和蛋氨酸賴氨酸二肽，而且其利用效率高于利用游離蛋氨酸的效率。為了研究影響酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)的最佳蛋氨酸二肽添加量，在培養(yǎng)液中添加60、70、80、90、100和110μg/ml蛋氨酸二肽，培養(yǎng)結(jié)果顯示：添加蛋氨酸二肽濃度在70μg/m

6、l時(shí)酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)到最大值，除了與添加60μg/ml組差異不顯著外與其它各濃度組間差異均顯著(P<0.05)。當(dāng)?shù)鞍彼岫牡奶砑訚舛雀哂?0μg/ml，隨著添加量的增加酪蛋白基因表達(dá)反而下降，但各組間差異不顯著。表明蛋氨酸二肽與蛋氨酸一樣有一個(gè)理想的添加濃度。 3．賴氨酸與蛋氨酸比例對(duì)酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)的影響通過體外培養(yǎng)，探討賴氨酸與蛋氨酸比例對(duì)酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)的影響。培養(yǎng)液中賴氨酸、蛋氨酸(57μ

7、g/ml)添加比例為1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1和4.5：1(每組三個(gè)重復(fù)，5×10<'4>個(gè)/孔)，培養(yǎng)48小時(shí)后，用胰蛋白酶和EDTA消化貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，通過構(gòu)建的RT-PER方法檢測(cè)體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)豐度。結(jié)果表明，當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸的比例在1：1-3.5：1時(shí)，隨著比例的升高酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)有上升的趨勢(shì)，當(dāng)比例高與3.5：1時(shí)，酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)略

8、有下降。賴氨酸和蛋氨酸比例在1：1-2.5：1的各組與比例在3：1-4.5：1組之間酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)，其余各組間差異均不顯著。 綜上所述：采用組織塊培養(yǎng)的方法收集的乳腺上皮細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中能正常生長(zhǎng)，可以用于體外培養(yǎng)研究；在體外培養(yǎng)體系中添加蛋氨酸二肽和賴氨酸蛋氨酸二肽，比添加相同含量的游離氨基酸更能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞酪蛋白α<,sl>基因表達(dá)；改變培養(yǎng)液中賴氨酸和蛋氨酸的比例能影響酪蛋白α<,