腦梗死后TDCS對pannexin1通道及神經可塑性的作用.pdf

1、研究背景和目的:
　　 每年全世界約有2200萬的新發(fā)腦卒中患者，2012年最新發(fā)表的國際卒中試驗3(The third international stroke trial，IST-3)研究表明，全球范圍內在60歲以上人群中腦卒中為第二大死亡原因，而在15-59歲人群死亡原因中居第五位。中國人群最主要的類型是缺血性腦卒中，約占43％～73％。逐年增長的發(fā)病率與其高致死率及高致殘率使腦卒中成為中國亟待解決的公眾健康難題，促進神經

2、功能恢復是腦梗死治療的基本途徑。神經功能恢復的結構基礎在于兩方面:一是腦梗死后早期神經結構最大限度的保留;二是腦梗死恢復期神經可塑性的調節(jié)。神經可塑性在腦梗死后的相當長時間內都可受到調節(jié)，后者是我們治療的主要方向。作為局部腦缺血的一種反應，在急性期過后的一段時間里，腦組織的自身修復過程被激活，然而這些內源性中樞神經系統(tǒng)重塑不足以使神經功能恢復。如何刺激、放大其內源性修復機制是我們面臨的重要問題，這個問題在近年來越來越受到重視。
　

3、　 目前認為神經可塑性在細胞結構水平表現(xiàn)為:樹突分支、軸突出芽、樹突棘密度、突觸數目以及受體密度的改變。腦梗死灶同側及對側的軸突重塑、樹突棘密度調節(jié)是腦梗死后神經結構修復以及自發(fā)神經功能恢復的關鍵因素。一般來說，缺血性腦卒中后誘發(fā)錐體神經元軸突發(fā)生Waller變性，其程度取決于缺血病灶的嚴重程度，進而軸突纖維沿著梗死灶邊緣發(fā)生再生重塑，存活的遠端錐體束軸突出芽，其實在病灶同側和對側均可見軸突末梢出芽的增強。不僅如此，跨胼胝體的聯(lián)合纖維

4、也發(fā)生了重塑以及軸突出芽。近期研究的數據表明:腦梗死灶周圍樹突棘密度的變化與神經功能的恢復密切相關。
　　 絕大多數樹突表面分布有樹突棘，每個樹突棘至少含有一個興奮性突觸，因而樹突棘對于腦神經元細胞之間的信號傳遞具有重要作用。樹突棘在生長發(fā)育過程中有三種結局:絕大多數參與突觸后成分的構成，一部分被修剪或沉默，另有小部分樹突棘進一步增長發(fā)育成3級或4級樹突。樹突棘的結構具有異質性，表現(xiàn)為不同類型，如最常見的呈蘑菇狀，以及蚓狀和短粗

5、狀。對于成年大腦，大多數樹突棘是處于一個穩(wěn)定狀態(tài)，但新近證據表明，在某些情況下樹突棘的結構可以發(fā)生顯著改變，突觸信號傳導的重塑可能因此而激活，樹突棘更新率可以在以下條件下得到增強:外界感覺刺激、控制神經興奮性包括長時程增強或長時程抑制、以及在某些神經疾病病理條件下。進一步的研究表明興奮性受體介導的電流強度、興奮性突觸后電位傳導、樹突棘頭端至母體樹突的細胞內鈣離子彌散動力學改變等，均與樹突棘形態(tài)學改變有關。因而樹突棘可塑性是中樞神經系統(tǒng)突

6、觸功能可塑性的一個重要方面。由于樹突棘具有受環(huán)境影響而表現(xiàn)出較強可塑性的特點，提示樹突棘對于腦可塑性的調節(jié)起到關鍵作用，那么在腦缺血病理情況下又起到哪些作用？
　　 腦缺血引起興奮性氨基酸毒性作用、鈣離子超載、自由基損傷、NO毒性作用、凋亡激活以及炎癥反應等一系列病理生理變化，神經元樹突繼之出現(xiàn)變性，其突出的形態(tài)學改變特點是沿著樹突莖出現(xiàn)曲張樣膨大，最初表現(xiàn)輕微，但隨著缺血狀態(tài)加重而逐漸加劇，最后常常表現(xiàn)為串珠樣。離體研究和在體

7、研究均可觀察到樹突的這種病理改變與缺血程度和病灶體積大小有關。正常情況下皮質樹突與毛細血管的間距平均為13μm，而缺血后最初幾個小時在血管周圍80μm仍可存在完整樹突。有研究認為體外培養(yǎng)皮質神經元經氧-糖剝奪或給與谷氨酸受體激動劑，將導致嚴重的樹突膨脹和形態(tài)學改變，但在缺血缺氧不超過2小時就能在結構上完全康復。在光化學法誘導的腦梗死模型上同樣可以觀察到受累樹突的康復，同時觀察到大多數再生的樹突棘重新分布定位于梗死灶周圍它們破壞、消失的位

8、點，這可能是因為突觸前成分在腦卒中早期處于相對較穩(wěn)定的狀態(tài)。有研究證明在海馬腦片上這些再生的樹突棘能誘發(fā)出來突觸反應，這證明再生的樹突棘是具有生理功能的。有研究表明腦卒中誘發(fā)激活樹突分支增多、樹突棘密度增加，這提示樹突和樹突棘的重塑是腦可塑性的基礎。
　　 根據大腦中動脈梗死后損傷情況，梗死的腦組織分為三個區(qū)域:永久缺血壞死區(qū)域，臨近的再灌注損傷、膠質瘢痕及細胞凋亡區(qū)域，外周的正常區(qū)域，缺血性腦梗死引發(fā)的神經修復再生過程主要發(fā)生

9、在后兩個區(qū)域。梗死灶周圍區(qū)域(peri-infarct region)處于梗死灶壞死核心的周圍，處于腦組織的低灌注區(qū)域，但目前就peri-infarct region的形成機制以及范圍大小仍有爭議。有研究將其界定為梗死灶壞死核心的周圍存活的組織區(qū)域，對于嚙齒類動物而言可能不到1mm，實際上此區(qū)域界定的模糊與再灌注時間、代謝以及細胞凋亡有關，與臨床“半暗帶”概念有相似之處。眾多研究表明該區(qū)域是神經再生發(fā)生的主要區(qū)域，因為有很多神經生長促進

10、和抑制因子表達在此發(fā)生重要的變化。另有電生理、影像學研究認為該區(qū)域在受到外界環(huán)境影響下更具有活性，肢體功能的早期康復與梗死周圍區(qū)域皮質功能重組有關。實際上腦組織的缺血性損害主要發(fā)生于梗死后的24小時內，在熒光標記的轉基因動物中觀察到缺血后樹突完整性破壞穩(wěn)定于梗死后的6小時之內，進一步離體研究表明受累樹突分支的數十微米內結構處于一個損害-修復的動態(tài)平衡，并且具有較為清楚的界限，然而在此界限邊緣看似未損傷的樹突其實在樹突棘水平發(fā)生著細微的變

11、化，主要表現(xiàn)為數目的進行性減少或是密度的下降。有體外研究認為缺血后樹突棘可有增長，提示增長的樹突棘可以限制破壞性離子電信號從頭端傳向樹突。越來越多研究表明在腦梗死后的數天至數周內，腦梗死周圍區(qū)域是神經可塑性的熱點區(qū)域，對神經功能康復具有重要意義。
　　 經顱直流電刺激(Transcranial direct current stimulation，TDCS)是近年來日益受到國內外學者的重視的康復技術，TDCS作為無創(chuàng)性腦刺激技術

12、之一具有其獨特的優(yōu)勢，可以和物理治療同步進行，而且安全性高。不少臨床研究觀察到TDCS對于肢體運動功能提高、記憶改善、鎮(zhèn)痛等方面具有肯定的療效，不僅如此，對于語言、吞咽的恢復也有幫助。但其作用機理目前尚不清楚，且未見系統(tǒng)的研究報道。TDCS可以通過電極定向、定位調節(jié)相應區(qū)域的神經網絡興奮性來促進神經功能恢復，是用來研究大腦活動性、促進神經可塑性的理想方法，而且近年來的研究表明TDCS能夠通過調節(jié)大腦活動影響神經可塑性，比rTMS具有更少

13、的副作用。如前所述，腦卒中誘發(fā)激活樹突分支增多、樹突棘密度增加，樹突和樹突棘的重塑是腦可塑性的基礎，且腦梗死病理生理過程本身就可以誘導病灶周圍的神經再生，特別是腦梗死周圍區(qū)域1-12周神經興奮性的增加對于肢體功能恢復至關重要。
　　 目前認為TDCS可以將足夠的電流引入大腦皮質，特點是不誘發(fā)動作電位，而只調節(jié)神經元的膜靜息電位，從而僅調節(jié)已經處于活動狀態(tài)的神經元興奮性。TDCS既能夠增強神經元的活動，也能抑制它們的活動，這要看電

14、流的方向和神經元的排列方式。大腦皮層神經元樹突指向頭皮方向，當帶正電荷的經顱直流電刺激電極（正極）靠近樹突時，電流就導致處于活動狀態(tài)的神經元興奮性增加，而負極的作用正好相反。有臨床研究觀察到興奮性氨基酸受體NMDAR阻滯劑右美沙芬可以阻斷TDCS作用于神經細胞的正極、負極效應，從而推測NMDA受體參與TDCS改變神經可塑性。另有研究觀察到卡馬西平選擇性消除了TDCS的正極效應而未影響負極效應，推測TDCS正極效應需要離子通道的參與，膜電

15、位去極化及細胞間相互作用可能是其主要機制之一。雖然TDCS作用于神經可塑性的機制目前仍不明確，需要進一步的動物實驗研究去探討，但上述研究為我們提供了研究切入點:神經細胞聯(lián)系通道——縫隙連接通道。
　　 目前縫隙連接通道在腦缺血中的作用日益受到關注。pannexins家族是近年來確定的組成通道的蛋白家族。目前研究認為缺血誘導pannexin1通道的開放，繼而膜通透性增加，同時出現(xiàn)陽離子電流的調節(jié)異常，此過程雖也有ASICla通道、

16、電壓依賴Na+通道、NMDA受體以及TRP通道的參與，但通道的電流震蕩是關鍵的環(huán)節(jié)。Pannexin1通道開放導致的電流震蕩使神經元持續(xù)處在膜靜息電位水平(-60mV)，這提示通道電流是導致缺氧去極化的主要成因，同時pannexin1通道的開放導致葡萄糖和ATP的外滲，以上從細胞水平說明pannexin1通道開放是導致缺血后神經電興奮性改變、神經細胞間通信的關鍵環(huán)節(jié)。有意思的是Pannexin1被發(fā)現(xiàn)和PSD-95（postsynapt

17、ic density protein95）共同存在于突觸后膜，參與影響突觸可塑性?？梢灶A見到腦梗死后雙側大腦半球的神經興奮性以及pannexin1通道誘導的電流震蕩是不平衡的，早期應用TDCS干預這種不平衡對于神經功能的康復有著重要意義。
　　 研究目的:
　　 腦梗死后TDCS干預有助于神經功能恢復，那TDCS對皮層神經元pannexin1通道、神經可塑性有何影響？我們預期通過本課題明確pannexin1通道在腦梗死后

18、的改變以及TDCS對其的影響，并初步探討TDCS的干預時機及其作用于神經功能重組的機制，為腦梗死后治療提供新的靶點，并為TDCS的應用提供理論依據。本課題采用大腦中動脈閉塞模型(MCAO)，對peri-infarct region進行如下觀察研究:
　　 1.觀察成年大鼠腦梗死后TDCS對腦梗死灶周圍區(qū)樹突棘形態(tài)學的影響;
　　 2.觀察成年大鼠腦梗死后TDCS對腦梗死灶周圍區(qū)pannexin1表達的影響;
　　

19、 3.結合TDCS對腦梗死大鼠行為學影響的觀察，探討TDCS促進神經可塑性的機制。
　　 方法:
　　 1、選用9～10周齡雄鼠，體重300-350g，共120只。從成功復制的MCAO模型大鼠中用隨機數字表隨機選取80只，其中40只作為單側大腦中動脈閉塞組（MCAO組）即腦梗死對照組，40只作為TDCS治療組，其余MCAO模型大鼠備用。主要觀察時間點設為3天、7天、14天。
　　 具體分組如下:
　　 1

20、) MCAO組(n=40):線栓法阻斷MCAO。
　　 其中36只用于研究TDCS對樹突棘密度、對Pannexin1 mRNA表達、Neurocan mRNA表達的影響，分3個時間點（3天、7天、14天），每組12只。第3組（14天組）的大鼠中取8只，采用走平衡木實驗在第3天、第7天、第14天進行神經功能評分。
　　 其余4只，其中1只用于TTC染色，1只用于Nissl染色，2只用于觀察Pannexin1和Neuroca

21、n在腦內的分布。
　　 2) TDCS治療組(n=40):線栓法阻斷MCA+TDCS治療。具體實驗動物分組方法與MCAO組相同。
　　 3)假手術組(n=40):僅暴露頸部動脈。具體實驗動物分組方法與MCAO組相同。
　　 2、大鼠肢體運動功能評定:采用走平衡木實驗(beam walking test)對運動協(xié)調功能進行神經功能評分。重復測量三次取平均值。
　　 3、TDCS刺激干預方法
　　 S

22、D大鼠MCAO后次日即給予直流電TDCS治療，采用G6805-2B型刺激儀（上海醫(yī)用電子儀器），參數設置為頻率10Hz，強度0.1mA，每天給予30分鐘。刺激電極位置:正極（上調興奮性）在耳間線后約2mm、中線偏右2-3mm，負極（下調興奮性）在耳間線前5mm、中線偏左2-3mm。在刺激的第3天、7天、14天分別選取相應大鼠處死進行下一步實驗。
　　 4、Golgi染色在光學顯微鏡下觀察皮質錐體神經元從二級樹突基部開始每20μm

23、長度范圍內的樹突棘個數，代表樹突棘密度。
　　 5、免疫組化檢測Pannexin1、Neurocan的表達分布，以及分別與MAP-2和GFAP的關系。
　　 6、熒光實時定量PCR檢測Pannexin1 mRNA、Neurocan mRNA的表達。
　　 統(tǒng)計學處理
　　 全部數據均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析比較。
　　 研究TDCS對行為學的影響采用重復測量方差分析，組內兩兩比較采用LSD

24、方法。
　　 研究TDCS對樹突棘密度、對Pannexin1 mRNA表達、Neurocan mRNA表達的影響采用析因設計方差分析，組內兩兩比較采用LSD方法。
　　 P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1、TDCS對腦梗死后神經功能的影響
　　 腦梗死后不同時間點之間(F=27.941，P＜0.001)、TDCS治療組和MCAO組之間(F=39.443，P＜0.001)的

25、評分差異有統(tǒng)計學意義，腦梗死后不同時間點與不同組別間無交互效應(F=2.294，P=0.119)。MCAO組在不同時間之間的評分差異有統(tǒng)計學意義(F=7.824，P=0.005)，TDCS治療組在不同時間之間的評分差異有統(tǒng)計學意義(F=24.843，P＜0.001)。TDCS治療組與MCAO組之間第3天（t=2.688，P=0.018）、第7天(t=5.789，P＜0.001)、第14天(t=5.017，P＜0.001)的BWT評分差異

26、有統(tǒng)計學意義，TDCS治療組的評分均低于MCAO組，提示TDCS治療組肢體功能較MCAO組好。MCAO組內BWT評分在第7天與第3天之間、第14天與第7天差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.170、0.20）;第14天BWT評分低于第3天，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)。TDCS組內第7天BWT評分低于第3天，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.040); BWT評分在第14天與第7天之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033);第14天BWT評分低

27、于第3天，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 2、TDCS對各組樹突棘的影響
　　 Golgi染色后通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SO組、MCAO組以及TDCS組的神經樹突棘大多呈蘑菇狀。MCAO組的樹突棘表現(xiàn)出缺失、或稀少的樹突棘。析因設計方差分析顯示不同分組間樹突棘密度差異有統(tǒng)計學意義(F=384.352，P＜0.001);而不同時間樹突棘密度差異有統(tǒng)計學差異(F=13.402，P＜0.001);干預因素（TDCS治療、

28、MCAO手術）和時間之間有交互效應(F=4.509，P=0.002)。TDCS治療組、MCAO組以及SO組術后第3天(F=195.773，P＜0.001)、7天(F=112.039，P＜0.001)、14天(F=100.864，P＜0.001)的樹突棘密度差異均有統(tǒng)計學意義。在術后第3天、7天、14天時MCAO組、SO組之間神經樹突棘密度差異有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.001），MCAO組神經樹突棘密度均較SO組降低。在術后第3天、7天

29、、14天時TDCS治療組與MCAO組之間神經樹突棘密度差異有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.001），TDCS治療組神經樹突棘密度均較MCAO組增高。在術后第3天、7天、14天時TDCS組與SO組之間神經樹突棘密度差異有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.05)。
　　 3、Pannexin1在腦內的分布
　　 Pannexin1在全腦均有表達，梗死灶側陽性信號較非梗死灶側強。大鼠大腦皮層的V2MM第二視皮質內側內區(qū)、V2ML第二視皮質

30、內側外區(qū)、Au1第一聽皮質、AuV第二聽皮質腹側區(qū)、海馬CA1/CA2/CA3/齒狀回(DG)、S1BF感覺皮質桶狀區(qū)、PMCo皮質后內側杏仁核、PLCo皮質后外側杏仁核、Pir梨形皮質、PtA頂葉聯(lián)絡皮質表達較強;其主要分布在皮層6層結構中的Ⅱ（外顆粒）層、Ⅲ（錐體細胞）層、Ⅳ（內顆粒）層及Ⅴ（外錐體）層中。
　　 雙重免疫熒光標記結果顯示:Pannexin1主要分布在皮層的錐體細胞、顆粒細胞中。Pannexin1與MAP-2

31、共定位后發(fā)現(xiàn):Pannexin1與MAP2均為陽性的細胞約占MAP2陽性細胞總數的80％～95％，可見Pannexin1在胞體及近端樹突中均有較強陽性信號表達，提示Pannexin1主要分布于神經元胞膜，部分表達于胞漿。
　　 4、TDCS對Pannexin1表達的影響
　　 RT-PCR檢測腦梗死周圍區(qū)域Pannexin1 mRNA相對表達量的變化。析因設計方差分析顯示不同分組(F=237.734，P＜0.001)、不

32、同時間(F=34.868，P＜0.001)差異均有統(tǒng)計學意義，干預因素（TDCS治療、MCAO手術）和時間之間有交互效應(F=45.483，P＜0.001)。TDCS治療組、MCAO組以及SO組術后第3天(F=77.498,P＜0.001)、7天(F=194.79,P＜0.001)、14天(F=70.962,P＜0.001)的Pannexin1 mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義。術后第3天、7天、14天時MCAO組與SO組Panne

33、xin1 mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，MCAO組Pannexin1 mRNA相對表達量均高于假手術組。術后第3天TDCS治療組Pannexin1 mRNA表達量與MCAO組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.264)，術后第7天、14天時TDCS治療組Pannexin1 mRNA相對表達量與MCAO組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，術后第7天、14天時TDCS治療組Pannexin1 mRNA表達量較MCAO組降

34、低。在術后第3天、7天、14天時TDCS組與SO組Pannexin1 mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 5、Neurocan在腦內分布
　　 Neurocan陽性信號主要分布于梗死灶周圍區(qū)域。GFAP陽性區(qū)域顯示增生的膠質細胞，Neurocan陽性區(qū)域呈不規(guī)則片狀分布，Neurocan和GFAP的雙標結果提示Neurocan陽性區(qū)域要大于GFAP陽性區(qū)域，Neurocan陽性染色主要分布于膠質

35、細胞及細胞間隙。
　　 6、TDCS對Neurocan表達的影響
　　 析因設計方差分析顯示不同分組(F=1986.124，P＜0.001)、不同時間(F=307.183，P＜0.001)梗死灶周圍Neurocan mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義，干預因素（TDCS治療、MCAO手術）和時間之間有交互效應(F=118.138，P＜0.001)。TDCS治療組、MCAO組以及SO組術后第3天(F=594.946，P＜

36、0.001)、7天(F=2484.108,P＜0.001)、14天的Pannexin1 mRNA(F=204.715,P＜0.001)相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義。在術后第3天、7天、14天時MCAO組與SO組Neurocan mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，MCAO組Neurocan mRNA相對表達量均較SO組增加。在術后第3天、7天、14天時TDCS治療組與MCAO組Neurocan mRNA相對表達量差異

37、均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，TDCS治療組Neurocan mRNA相對表達量均較MCAO組降低。在術后3天、7天時TDCS治療組與SO組Neurocan mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，但在14天時TDCS治療組與SO組Neurocan mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.741)。
　　 結論:
　　 TDCS促進腦梗死早期肢體功能康復的機制之一可能是增加了腦梗死后梗死灶周圍的樹突

38、棘密度，表明其改善神經功能的重要機制之一是促進了神經可塑性。在腦梗死后的早期應用TDCS會有更好的運動功能恢復，而且能夠下調pannexin1 mRNA的表達。同時我們觀察到早期應用TDCS可以抑制NeurocanmRNA的表達。
　　 1.腦梗死周圍區(qū)域樹突棘密度在腦梗死后呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，TDCS則促進腦梗死后的樹突棘再生，使樹突棘密度增加;
　　 2.Pannexin1廣泛分布于大腦皮層、海馬，定位于胞膜，部分表