梓醇促神經(jīng)修復(fù)作用及其腦可塑性機(jī)制研究.pdf

1、目的: 1．觀察梓醇對(duì)離體培養(yǎng)的SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元生存活性及軸突生長(zhǎng)的影響； 2．觀察梓醇對(duì)大鼠局灶腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)有無(wú)促進(jìn)作用； 3．了解梓醇能否透過(guò)血腦屏障； 4．了解梓醇能否促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)元軸突和樹(shù)突生長(zhǎng)； 5．了解梓醇能否促進(jìn)腦缺血后軸突有效芽生，增強(qiáng)突觸重構(gòu)； 方法: 一、離體實(shí)驗(yàn)研究離體培養(yǎng)SD大鼠乳鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，以不同濃度的梓醇干預(yù)培養(yǎng)至第6天的神經(jīng)元，采用MT

2、T法測(cè)定神經(jīng)元生存活力和鏡下觀察并用測(cè)微尺測(cè)量軸突長(zhǎng)度，了解梓醇對(duì)離體培養(yǎng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的影響。 二、在體實(shí)驗(yàn)研究 1．開(kāi)顱法制備SD大鼠局灶性永久性腦缺血模型。造模成功后分為模型組、生理鹽水組、梓醇低、中、高劑量治療組和胞磷膽堿陽(yáng)性藥物對(duì)照組，同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組為對(duì)照。以腹腔注射給予不同劑量梓醇為干預(yù)措施，首次給藥時(shí)間分為腦缺血后 6h 或腦缺血后24h，每天給藥一次，連續(xù)7天； 2．采用Bederson 評(píng)分、

3、肌力測(cè)試、平衡木試驗(yàn)和前肢技巧性食物抓取試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組神經(jīng)功能恢復(fù)狀況； 3．采用高效液相色譜技術(shù)定性檢測(cè)梓醇能否進(jìn)入腦脊液； 4．采用Golgi-Cox染色顯示神經(jīng)元樹(shù)突和樹(shù)突棘，觀察梓醇對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突生長(zhǎng)的影響； 5．采用免疫熒光組化和 Western blot 檢測(cè)新生軸突和突觸分子標(biāo)志GAP-43和P38蛋白表達(dá)，觀察梓醇對(duì)腦缺血后神經(jīng)元軸突新生和突觸重構(gòu)的影響； 6．采用電鏡技術(shù)觀測(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)

4、突觸數(shù)目，觀察梓醇對(duì)腦缺血后神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響； 7．采用神經(jīng)示蹤和免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)顯示脊髓頸膨大區(qū)皮質(zhì)脊髓束芽生纖維以及腦缺血灶周圍殘存大腦皮質(zhì)與健側(cè)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)的纖維聯(lián)系，觀察梓醇對(duì)長(zhǎng)距離軸突芽生的影響； 8．采用免疫熒光組化和Western blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組Nogo A、NgR、BDNF和trkB蛋白表達(dá)變化，初步探討梓醇促神經(jīng)修復(fù)作用分子基礎(chǔ)。 結(jié)果: 一、離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梓醇對(duì)神經(jīng)元生

5、存活性無(wú)明顯影響。 二、在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．證實(shí)梓醇對(duì)腦缺血后功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。梓醇對(duì)腦缺血后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。腦缺血后延遲給予梓醇治療仍促進(jìn)大鼠功能恢復(fù)。 2.梓醇能夠通過(guò)血腦屏障給藥后40min的大鼠腦脊液，HPLC法檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間為10.4min處可見(jiàn)梓醇的紫外吸收峰，與腦脊液加樣對(duì)照梓醇的紫外吸收峰保留時(shí)間相同，表明給藥后梓醇分布到大鼠腦脊液中。 3.梓醇促進(jìn)大鼠腦缺血后神經(jīng)元軸

6、突和樹(shù)突生長(zhǎng)作用及可能機(jī)制 (1)梓醇促進(jìn)缺血灶周圍大腦皮質(zhì)GAP-43蛋白表達(dá)GAP-43是神經(jīng)元新生軸突的分子標(biāo)志。梓醇對(duì)神經(jīng)元軸突新生有促進(jìn)作用。 (2)腦缺血后缺血灶周圍大腦皮質(zhì)神經(jīng)元樹(shù)突分支和樹(shù)突棘密度均明顯減少；梓醇可促進(jìn)樹(shù)突分叉，增加樹(shù)突棘密度。 (3)梓醇增強(qiáng)缺血灶周圍大腦皮質(zhì)芽生軸突與健側(cè)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)的聯(lián)系綠色熒光顯示BDA標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞和纖維，綠色熒光強(qiáng)度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質(zhì)內(nèi)BD

7、A標(biāo)記纖維的數(shù)量越多。紅色熒光標(biāo)記GAP-43表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞和軸突，紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)越大反映缺血灶周圍大腦皮質(zhì)具有生長(zhǎng)反應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞和新生突纖維的數(shù)量越多。兩者共定位呈黃色，顯示缺血灶周圍皮質(zhì)新生的芽生軸突已經(jīng)與健側(cè)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)建立纖維聯(lián)系；Person 相關(guān)系數(shù)反映芽生軸突被BDA標(biāo)記的頻度，其值越大反映缺血灶周圍皮質(zhì)芽生軸突與健側(cè)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)的纖維聯(lián)系越密切。結(jié)果綠色熒光強(qiáng)度系數(shù)各實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯差異(p>0.05)，紅色熒光強(qiáng)

8、度系數(shù)梓醇中劑量組明顯大于假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組(p<0.05)，提示梓醇可明顯促進(jìn)缺血灶周圍皮質(zhì)神經(jīng)元軸突芽生。Pearson 相關(guān)系數(shù)模型組較假手術(shù)組明顯增加(p<0.05)，梓醇中劑量組明顯大于模型組和胞磷膽堿組(p<0.05)。 (4)梓醇增加脊髓頸膨大區(qū)健側(cè)皮質(zhì)脊髓束越邊纖維數(shù)量大鼠皮質(zhì)脊髓束在脊髓頸膨大節(jié)段集中走行在脊髓后(背)索。正常情況下，皮質(zhì)脊髓束絕大部分纖維發(fā)枝支配同側(cè)脊髓前角，很少越邊支配

9、對(duì)側(cè)脊髓前角。腦缺血后，模型組健側(cè)皮質(zhì)脊髓束越邊纖維占4.7％±1.3％，較假手術(shù)組1.4％±0.5％明顯增加(p<0.05)，提示健側(cè)大腦半球感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)在腦缺血后功能恢復(fù)過(guò)程可能發(fā)揮重要作用。梓醇干預(yù)后，健側(cè)皮質(zhì)脊髓束越邊纖維占8.5％±2.1％，較模型組和胞磷膽堿組(5.5％±1.8％)明顯增加(p<0.05)。 (5)梓醇促進(jìn)脊髓頸膨大區(qū)健側(cè)皮質(zhì)脊髓束纖維芽生用綠色熒光顯示 BDA 標(biāo)記的健側(cè)皮質(zhì)脊髓束，紅色熒光顯示GA

10、P-43表達(dá)陽(yáng)性的新生軸突纖維，BDA/GAP-43共定位后呈黃色，BDA/GAP-43共定位分析，紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)越大GAP-43表達(dá)水平越高；Person 相關(guān)系數(shù)越大脊髓頸膨大區(qū)健側(cè)皮質(zhì)脊髓束新生的芽生軸突越多。模型組紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)明顯大于假手術(shù)組(p<0.05)；梓醇組較其他各實(shí)驗(yàn)組均明顯增大(p<0.05)；模型組 Pearson 相關(guān)系數(shù)明顯大于假手術(shù)組(p<0.05)，梓醇組較模型組和胞磷膽堿組均明顯增大(p<0.05)

11、。 (6)梓醇下調(diào)健側(cè)大腦皮質(zhì)Nogo-A蛋白表達(dá) Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色，分布在損傷側(cè)和健側(cè)大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)。大腦皮層Nogo-A陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/視野)假手術(shù)組為56．33±5．51，模型組為213．33±3．78，差異具有顯著性(p<0.05)；梓醇中、高劑量組分別為121．5±8．35和100．33±7．5 1，均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westen blot檢測(cè)結(jié)果與此

12、相符。 (7)梓醇下調(diào)健側(cè)大腦皮質(zhì)NgR蛋白表達(dá)損傷側(cè)和健側(cè)大腦皮層、海馬、紋狀體等腦區(qū)均可見(jiàn)NgR陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿和突起呈綠色，細(xì)胞核未著色，具有神經(jīng)元的典型形態(tài)特征。健側(cè)大腦皮質(zhì)NgR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)假手術(shù)組、模型組和生理鹽水組組間差異無(wú)顯著性(p>0.05)，提示腦缺血后15天，大腦皮質(zhì)內(nèi)NgR表達(dá)水平接近正常生理狀態(tài)。梓醇中、高劑量組NgR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均比模型組、生理鹽水組和胞磷膽堿組明顯減少(p<0.05)。Westen blo

13、t檢測(cè)結(jié)果與NgR原位檢測(cè)結(jié)果相符。 4．梓醇對(duì)大鼠腦缺血后突觸重構(gòu)的誘導(dǎo)作用及可能機(jī)制 (1)梓醇上調(diào)腦缺血后腦內(nèi)突觸素蛋白表達(dá)突觸素(P38)是突觸的分子標(biāo)志，用FITC標(biāo)記，呈現(xiàn)綠色熒光。陽(yáng)性著色部位呈大小較均勻的點(diǎn)狀或顆粒狀，主要分布在神經(jīng)氈內(nèi)。 陽(yáng)性著色部位IOD值模型組和生理鹽水組與假手術(shù)組差異無(wú)顯著性(P>0.05)，梓醇中、高劑量組均顯著高于模型組和胞磷膽堿組(p<0.05)。Western bl

14、ot半定量分析結(jié)果與此基本一致。提示梓醇能上調(diào)腦缺血后腦內(nèi)突觸素蛋白表達(dá)。 (2)梓醇增加大腦感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目電鏡下，感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目除假手術(shù)組外，各實(shí)驗(yàn)組缺血側(cè)均比健側(cè)減少。模型組健側(cè)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目與假手術(shù)組差異無(wú)顯著性(p>0.05)，但缺血側(cè)明顯少于假手術(shù)組(p<0.05)，提示腦缺血后存在突觸丟失現(xiàn)象；梓醇中劑量組健側(cè)和缺血側(cè)均比模型組和生理鹽水組明顯增加(p<0.05)，但與胞磷膽堿組差異無(wú)顯

15、著性(p>0.05)，提示梓醇對(duì)腦缺血后突觸重構(gòu)有明顯促進(jìn)作用。 (3)梓醇促進(jìn)缺血灶周圍大腦皮質(zhì)新生軸突形成突觸連接綠色熒光顯示P38標(biāo)記的突觸前末端，紅色熒光顯示GAP-43表達(dá)陽(yáng)性的軸突纖維，GAP-43/P38共定位后呈現(xiàn)黃色，顯示新生軸突形成的突觸末端。用Pearson相關(guān)系數(shù)反映GAP-43/P38共定位頻度。Pearson 相關(guān)系數(shù)越大說(shuō)明新生軸突形成突觸越多。模型組和生理鹽水組Pearson相關(guān)系數(shù)明顯大于假手術(shù)

16、組(p<0.05)，提示腦缺血可刺激新生軸突形成突觸連接；梓醇各劑量組均比模型組明顯增大(p<0.05)，且梓醇中、高劑量組明顯大于胞磷膽堿組(p<0.05)。提示梓醇可增強(qiáng)腦缺血后新生軸突形成新的突觸連接，促進(jìn)腦缺血后有效軸突芽生。 (4)梓醇上調(diào)缺血灶周圍大腦皮質(zhì)BDNF蛋白表達(dá)BDNF陽(yáng)性細(xì)胞被Cy3標(biāo)記，胞漿和突起呈現(xiàn)紅色，胞核不著色，陽(yáng)性細(xì)胞主要為神經(jīng)元。BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)模型組和生理鹽水組均較假手術(shù)組明顯增加(P<0

17、.05)，提示腦缺血后BDNF表達(dá)上調(diào)；梓醇治療組均比模型組明顯增加(P<0.05)，且梓醇中、高劑量治療組也比胞磷膽堿組明顯增加(P<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與此相符。提示梓醇可上調(diào)腦缺血后BDNF蛋白表達(dá)。 (5)梓醇上調(diào)缺血灶周圍大腦皮質(zhì)TrkB蛋白表達(dá)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞胞漿和突起被FITC標(biāo)記，呈現(xiàn)綠色，胞核不著色。缺血灶周圍大腦皮質(zhì)TrkB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)模型組較假手術(shù)組有減少趨勢(shì)，但差異無(wú)顯著性(P>0.