小鼠腦梗死后腦組織Pannexin1與HDAC9的表達(dá)改變及其意義.pdf

1、背景:
　　根據(jù)全球流行病學(xué)的調(diào)查，腦卒中(Cerebral Stroke)是導(dǎo)致人類死亡的第二大病因，其中缺血性腦卒中是腦血管病中最常見(jiàn)的一種類型，由于其高致殘率與高死亡率等原因，腦卒中仍然對(duì)人類生命健康構(gòu)成重大的威脅?，F(xiàn)今缺血性腦卒中的治療手段十分有限，至今仍缺乏有效的臨床治療藥物。深入研究缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制以及尋找其潛在的治療靶點(diǎn)是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。
　　Pannexin1廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要位于

2、細(xì)胞膜上，形成膜通道結(jié)構(gòu)。已有研究發(fā)現(xiàn)基于Pannexin1的腦梗死治療策略在部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，但對(duì)于Pannexin1蛋白在腦梗死中的表達(dá)情況尚未有較深入研究。因此本課題通過(guò)小鼠腦缺血模型探討Pannexin1表達(dá)的改變，希望為后續(xù)Pannexin1在腦梗死的作用與機(jī)制的研究提供新的理論依據(jù)。
　　最近研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)機(jī)制組蛋白去乙?；仍谌毖阅X梗死的病理機(jī)制中也起到重要的作用。在動(dòng)物腦梗死模型上多種組蛋白去乙?；?/p>

3、抑制劑(HDACs Inhibitors)也被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用，HDACs家族具有多個(gè)亞型，部分亞型的作用與機(jī)制已被探討，其中組蛋白去乙?；?(HDAC9)在腦梗死中的作用尚未深入研究。因此，本課題通過(guò)觀察HDAC9在腦梗死后表達(dá)的情況，探索其與腦梗死發(fā)生的關(guān)系，從而進(jìn)一步了解HDAC9在缺血性腦卒中的相關(guān)機(jī)制。
　　第一部分 小鼠腦梗死后腦組織Pannexin1的表達(dá)改變及其意義
　　目的:
　　檢測(cè)線栓法大腦

4、中動(dòng)脈阻塞(MCAO)后小鼠不同部位腦組織Pannexin1在卒中后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，探討Pannexin1與缺血性腦卒中的關(guān)系。
　　方法:
　　健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組與模型組，模型組按照Koizumi's線栓法進(jìn)行小鼠腦梗死模型的構(gòu)建，假手術(shù)組只進(jìn)行頸部正中縱行剖開(kāi)后縫合。模型組根據(jù)術(shù)后不同時(shí)間(4h，8h，12h，1d，3d，7d and14d)提取健側(cè)與患側(cè)腦組織。采用免疫熒光染色觀察P

5、annexin1腦組織內(nèi)分布位置，以及腦梗死后Pannexin1分別與MAP2和GFAP的關(guān)系，采用Western免疫印跡法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組不同部位（梗死側(cè)/對(duì)側(cè)皮層//假手術(shù)組皮層）Pannexin1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光染色:梗死灶周圍腦組織Pannexin1的熒光強(qiáng)度較其他部位明顯增強(qiáng)。
　　2.免疫熒光雙標(biāo)染色:Pannexin1與MAP2存在共定位，與GFAP不存在共定位表達(dá)

6、。
　　3.蛋白與mRNA表達(dá)檢測(cè):(1)小鼠梗死側(cè)腦組織Pannexin1的表達(dá)比健側(cè)大腦及對(duì)照組高，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，mRNA與蛋白表達(dá)的情況相似。(2)腦梗死后4小時(shí)，Pannexin1的表達(dá)已出現(xiàn)上調(diào)，到梗死后3天達(dá)到高峰，而后逐步下降，到14天Pannexin1的表達(dá)仍高于對(duì)照組。(3)進(jìn)一步檢測(cè)Pannexin蛋白家族另一亞型Pannexin2表達(dá)情況:腦梗死后Pannexin2蛋白并沒(méi)有發(fā)生上調(diào)或下調(diào)

7、。
　　結(jié)論:
　　1.腦梗死后P annexin1表達(dá)的上調(diào)及隨時(shí)間表達(dá)改變的情況，進(jìn)一步說(shuō)明Pannexin1與缺血性卒中密切相關(guān)。
　　2.小鼠腦梗死后Pannexin1主要在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，而非星形膠質(zhì)細(xì)胞上。
　　3.Pannexin2蛋白可能不與Pannexin1協(xié)同參與腦梗死的病理過(guò)程。
　　第二部分 小鼠腦梗死后腦組織HDAC9的表達(dá)改變及其意義
　　目的:
　　檢測(cè)線栓法大腦中動(dòng)

8、脈阻塞(MCAO)后小鼠不同部位腦組織HDCA9的表達(dá)及胞內(nèi)分布變化，探討HDAC9與缺血性腦卒中的關(guān)系。
　　方法:
　　健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組:假手術(shù)組與模型組，模型組按照Koizumi's線栓法進(jìn)行小鼠腦梗死模型的構(gòu)建，假手術(shù)組只進(jìn)行頸部正中縱行剖開(kāi)后縫合。采用免疫熒光染色觀察HDAC9腦組織內(nèi)分布位置與胞內(nèi)分布變化，采用Western免疫印跡法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組不同部位（梗死側(cè)/對(duì)側(cè)皮層/

9、MCAO組小腦/假手術(shù)組皮層/假手術(shù)組小腦）HDAC9的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光染色:(1)腦梗死后，梗死灶周圍腦組織HDAC9的熒光強(qiáng)度較其他部位明顯增強(qiáng)。(2)高倍鏡下與假手術(shù)組對(duì)比，梗死灶周圍HDAC9胞漿內(nèi)表達(dá)增多，核內(nèi)表達(dá)減少。
　　2.蛋白與mRNA表達(dá)檢測(cè):與各組對(duì)比，梗死側(cè)腦組織HDAC9表達(dá)顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），蛋白與mRNA表達(dá)情況相一致。
　　結(jié)論: