Benzonase酶對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的影響.pdf

1、目的:
　　1、分析金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌臨床分離株的生物膜形成能力。
　　2、研究Benzonase酶對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的作用。
　　3、研究抗菌藥物與Benzonase酶聯(lián)合作用對(duì)生物膜內(nèi)活菌數(shù)量的影響。
　　方法:
　　1、剛果紅瓊脂(CRA)試驗(yàn)和黏附試驗(yàn)檢測(cè)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成能力，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)生物膜形成相關(guān)基因icaA。
　　2、

2、離心柱吸附法提取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜內(nèi)的胞外DNA(eDNA)，Benzonase酶消化后瓊脂糖凝膠電泳觀察。
　　3、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌用胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后形成的生物膜，用含不同濃度Benzonase酶的TSB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h分別進(jìn)行如下處理:甲醇固定，結(jié)晶紫染色，冰醋酸溶解后檢測(cè)其570nm處的吸光度值(OD570);平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)生物膜內(nèi)的活菌數(shù);甲醇固定，結(jié)晶紫染色

3、，光學(xué)顯微鏡下觀察;干燥固定，噴金后掃描電鏡下觀察。
　　4、微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌對(duì)10種抗菌藥物的敏感性，選取其中3種敏感的抗菌藥物分別與Benzonase酶聯(lián)合作用于菌株形成的生物膜，平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)生物膜內(nèi)的活菌數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1、收集的29株金黃色葡萄球菌和23株表皮葡萄球菌臨床分離株中，其中CRA試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株分別為19株和17株，黏附試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株也分別為19株和17株;P

4、CR擴(kuò)增檢測(cè)icaA基因，金黃色葡萄球菌中有18株陽(yáng)性，表皮葡萄球菌中有17株陽(yáng)性。
　　2、提取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的eDNA，瓊脂糖凝膠電泳分離后可見(jiàn)一條約15kb大小的條帶;用Benzonase酶消化eDNA后，凝膠電泳未見(jiàn)條帶。
　　3、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后形成的生物膜，分別用不同濃度Benzonase酶的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，其生物膜的含量和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)隨著B(niǎo)enzo

5、nase酶濃度的升高而降低。當(dāng)Benzonase酶的濃度分別超過(guò)0.2U/ml和0.02U/ml時(shí)，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的OD570值和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)下降不再發(fā)生變化。光鏡和掃描電鏡下觀察不同濃度Benzonase酶處理的生物膜，其形態(tài)發(fā)生明顯變化。
　　4、慶大霉素、利福平、萬(wàn)古霉素分別與Benzonase酶聯(lián)合作用金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌培養(yǎng)24h形成的生物膜，其生物膜內(nèi)的活菌數(shù)下降程度比抗菌藥物單獨(dú)應(yīng)用時(shí)

6、明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、從感染患者體液標(biāo)本和分泌物標(biāo)本中分離得到的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中存在高比例的生物膜形成陽(yáng)性菌株。
　　2、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜中的eDNA通過(guò)DNA離心吸附柱方法分離得到的大小為15kb左右。
　　3、極微量濃度的Benzonase酶就能將生物膜中的eDNA降解，破壞生物膜的穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，使生物膜的含量和生物膜內(nèi)的活菌數(shù)大幅下降。
　　4、抗菌