CCK-8調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)ECV-304NF-κB表達(dá)的受體機(jī)制研究.pdf

1、目的：脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)引起的內(nèi)毒素休克是一種常見(jiàn)的危重病理過(guò)程，死亡率可達(dá)50％～80％。血管功能紊亂、循環(huán)阻力降低及體循環(huán)血壓進(jìn)行性降低是內(nèi)毒素休克的特征性病理變化之一。業(yè)已公認(rèn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell，VEC)不僅是機(jī)體血管的重要生物屏障，而且還具有內(nèi)分泌功能。在生理?xiàng)l件下，VEC的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生適量一氧化氮(NO)參與調(diào)節(jié)血管緊張度和器

2、官血流量的分布；在內(nèi)毒素休克發(fā)病過(guò)程中，VEC的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)明顯上調(diào)、活性增高并產(chǎn)生大量的NO，導(dǎo)致VEC的激活和功能障礙，而VEC功能障礙在血管功能紊亂、循環(huán)衰竭的發(fā)生中至關(guān)重要。iNOS的表達(dá)調(diào)控主要在基因水平進(jìn)行，VEC核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)在LPS誘生iNOS過(guò)程中起重要作用，NF-κB激活后能與iNOS基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)節(jié)iNOS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因此，若能適度抑制VECN

3、F-κB的活性，有助于減輕由iNOS誘生NO所導(dǎo)致的VEC損傷，改善內(nèi)毒素休克血管功能紊亂。 八肽膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide，CCK-8)具有明確的抗休克作用。研究表明，CCK-8可使內(nèi)毒素休克和失血性休克大鼠的平均動(dòng)脈壓(MAP)回升，提高其生存率；在離體條件下CCK-8可明顯減輕LPS誘導(dǎo)的VEC結(jié)構(gòu)損傷，改善內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)，而提高血管收縮反應(yīng)；CCK-8可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NF-

4、κB活性；CCK受體(cholecystokininreceptor,CCK-R)主要有兩種亞型即：CCK-AR及CCK-BR，CCK-8的抗休克作用可能由其受體介導(dǎo)。然而，有關(guān)CCK-8的抗內(nèi)毒素休克作用的機(jī)制尚未完全闡明，迄今為止，VEC是否存在CCK-R以及CCK-8對(duì)VECNF-κB的表達(dá)有無(wú)影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304為研究對(duì)象，觀察CCK-AR及CCK-BRmRNA在ECV-304中的表達(dá)，并初步

5、探討CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)ECV-304NF-κB蛋白表達(dá)影響的受體機(jī)制。 方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV-304，傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整細(xì)胞密度為每瓶1×107細(xì)胞，加入無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液及不同處理因素檢測(cè)下列指標(biāo)。 RT-PCR檢測(cè)CCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS量效組及LPS時(shí)效組。細(xì)胞分別用與實(shí)驗(yàn)組等體積無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液，0.01～10mg/LLPS作用

6、2h或1mg/LLPS分別作用0.5h，2h，6h和12h。用RT-PCR方法檢測(cè)ECV-304細(xì)胞CCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)水平，并用Gel-pro凝膠分析軟件對(duì)RT-PCR結(jié)果進(jìn)行半定量分析。 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)NF-κBp65蛋白表達(dá)。先將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶消化成細(xì)胞懸液并移至六孔板內(nèi)靜置24h。實(shí)驗(yàn)分組如下：①對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組等體積無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液；②LPS組：細(xì)胞培養(yǎng)液中加入1mg/LLPS；

7、③CCK+LPS組：細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入10-8mol/LCCK-8，10mm后加入1mg/LLPS；④CR-1409+CCK+LPS組：細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入10-5mol/LCR-1409，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min后加入1mg/LLPS；⑤CR-2945+CCK+LPS組：細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入10-5mol/LCR-2945，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min加入1mg/LLPS；⑥Pr

8、o+CCK+LPS組：細(xì)胞培養(yǎng)液中先加入2mg/L丙谷胺(Pro)，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min后加入1mg/LLPS。CR-1409、CR-2945分別是CCK-AR、CCK-BR的特異性拮抗劑，Pro是CCK-AR、CCK-BR的非選擇性拮抗劑。各組細(xì)胞于LPS刺激1h后終止各處理因素的作用，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)NF-κBp65的蛋白表達(dá)及細(xì)胞定位變化。用江蘇捷達(dá)801系列形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)NF-κB

9、p65蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出每張玻片的平均灰度值。 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果：1在ECV-304中存在著CCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)，其中，CCK-ARmRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為320bp，CCK-BRmRNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為332bp；測(cè)

10、序結(jié)果經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)顯示，與Genebank中CCK-AR及CCK-BRmRNA序列完全吻合。 2LPS對(duì)ECV-304CCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)的影響。(1)與對(duì)照組相比，0.01、0.1及1.0mg/LLPS孵育細(xì)胞2h可劑量依賴(lài)性引起CCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，其中0.01mg/LLPS誘導(dǎo)CCK-ARmRNA效應(yīng)不明顯，而可明顯誘導(dǎo)CCK-BRmRNA表達(dá)；與1mg/L

11、LPS組相比，10mg/LLPS孵育細(xì)胞2hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)未繼續(xù)出現(xiàn)明顯升高(P＞0.05)。(2)與對(duì)照組相比，1mg/LLPS孵育細(xì)胞0.5～2hCCK-AR及CCK-BRmRNA呈時(shí)間依賴(lài)性表達(dá)升高(P＜0.05)；與LPS孵育2h相比，1mg/LLPS孵育細(xì)胞6hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)開(kāi)始下降(P＜0.05)，但與對(duì)照組相比仍處于較高水平(P＜0.05)；與LPS孵育6h相比，1mg/LL

12、PS孵育細(xì)胞12hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達(dá)進(jìn)一步降低(P＜0.05)，與對(duì)照組相比已無(wú)明顯差異(P＞0.05)。 3CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)ECV-304NF-κBp65蛋白表達(dá)的影響。溶劑對(duì)照組ECV-304中有少量NF-κBp65蛋白表達(dá)，主要分布于胞漿中，而胞核中較少；1mg/LLPS孵育ECV-3041h胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比有明顯差異(P＜0.01)；CCK-8與LPS共同作用

13、，胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯降低，與LPS組相比有明顯差異(P＜0.01)；預(yù)先用CR-1409、CR-2945孵育細(xì)胞30min后再給予CCK-8和LPS處理，胞核中NF-κBp65蛋白表達(dá)與CCK+LPS組相比明顯升高(P＜0.05)，但仍低于LPS組(P＜0.05)，其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409更明顯(P＜0.05)；Pro可完全翻轉(zhuǎn)CCK-8的抑制效應(yīng)。 結(jié)論：ECV-304存在著CCK-AR和C