VP466-Rab-tropomyosin-actin復(fù)合體在對蝦免疫以及白斑綜合癥病毒(WSSV)感染過程中的作用研究.pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)，是一種嚴(yán)重危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病原。本文從病原和宿主兩方面入手，著重探討了WSSV病毒的主要膜蛋白VP466與對蝦體內(nèi)蛋白Rab、原肌球蛋白以及肌動蛋白之間形成的復(fù)合體在對蝦的免疫和病毒的感染過程中的所起的重要作用，不僅為在宿主體內(nèi)尋找病毒膜蛋白受體提供了理論基礎(chǔ)而且為建立有效的防治方法提供了科學(xué)依據(jù)。 本文首先證明了VP466-Rab-tropomyosin-actin是一個復(fù)合體。根據(jù)GST-

2、pulldown、質(zhì)譜的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Rab蛋白與對蝦白斑綜合癥病毒的膜蛋白VP466、肌動蛋白(actin)、原肌球蛋白(tropomyosin)之間存在互作。采用共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞、免疫共沉淀、Western分析等方法，在體內(nèi)和體外都證明了病毒的膜蛋白VP466和Rab、tropomyosin以及actin之間確實存在互作，并且也進一步驗證了VP466與Rab、tropomyosin蛋白的互作片段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP466的C-端既可以與Rab蛋

3、白也可以與tropomyosin蛋白互作，并且都是在同一區(qū)域。其次是對VP466-Rab-tropomyosin-actin這個復(fù)合體的功能開展研究。研究發(fā)現(xiàn)，其一，VP466蛋白通過與Rab蛋白以及actin之間的結(jié)合在宿主本身的免疫反應(yīng)中有重要作用。當(dāng)RNAi抑制Rab基因表達，血細胞吞噬活性減弱，病毒拷貝數(shù)上升；體外注射mRNA使Rab基因表達上調(diào)時，結(jié)果血細胞吞噬活性增強，病毒拷貝數(shù)下降。體外體內(nèi)試驗證明，VP466蛋白可以促進

4、Rab GTPase酶活升高。因此，宿主對病毒免疫反應(yīng)的一條可能途徑是，細胞內(nèi)Rab蛋白識別病毒膜蛋白VP466，與其結(jié)合后酶活升高，促進actin向有利于吞噬的反方向發(fā)生變構(gòu)，從而提高血細胞的吞噬病毒的能力，導(dǎo)致病毒拷貝數(shù)的降低。其二，VP466蛋白通過與tropomyosin以及actin之間的結(jié)合有利于病毒自身的感染。采用RNAi抑制VP466基因表達時，通過Real—time PCR．分析發(fā)現(xiàn)病毒的拷貝數(shù)是下降的，說明了VP46

5、6蛋白在WSSV病毒的感染過程中起重要作用。采用RNAi抑制tropomyosin基因表達時，通過Real—timePCR、病毒的半定量PCR分析發(fā)現(xiàn)病毒的拷貝數(shù)是下降的。因此，病毒感染的一條可能途徑是，病毒膜蛋白VP466與細胞骨架蛋白tropomyosin蛋白及actin之間結(jié)合，通過骨架蛋白的運動，有利于病毒自身的感染。其三，通過缺失突變發(fā)現(xiàn)，VP466與Rab和tropomyosin結(jié)合的位點在同一結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)，推測它們的結(jié)合是一