5-羥色胺1A受體在顳葉癲癇中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　癲癇是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特點(diǎn)是神經(jīng)元的異常興奮和同步化放電。癲癇持續(xù)狀態(tài)（Status epilepticus，SE）時(shí)死亡率高達(dá)20％。慢性癲癇長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作也可引起不可逆的神經(jīng)功能損害，導(dǎo)致遺留嚴(yán)重的認(rèn)知功能損害和行為改變。雖然臨床已有多種抗癲癇藥物，但對(duì)于難治性癲癇的療效仍然有限，需要進(jìn)一步尋找新的治療靶點(diǎn)。
　　5-羥色胺(Serotonin，5-HT)是一種腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，與抑制癲癇活動(dòng)密切相

2、關(guān)。5-HT受體在腦內(nèi)共有超過(guò)14種亞型，其中5-HT1A受體與癲癇關(guān)系最為密切[2-4]。目前5-HT1A受體在急性和慢性癲癇動(dòng)物模型中究竟是抑制還是促進(jìn)癲癇作用仍存在一定的爭(zhēng)議。這種截然相反的作用可能和各個(gè)癲癇模型的機(jī)制不同相關(guān)。pilocarpine模型相比KA模型更能全面模擬SE過(guò)程中的各種特性和長(zhǎng)時(shí)間SE發(fā)作所帶來(lái)的嚴(yán)重?fù)p害。而杏仁核慢性電點(diǎn)燃模型能較好模擬慢性顳葉癲癇發(fā)生過(guò)程，因此采用該兩種模型來(lái)研究5-HT1A受體在急性和

3、慢性癲癇過(guò)程中的作用，能提供更好的科學(xué)價(jià)值。
　　5-HT1A受體在腦內(nèi)分布廣泛，主要分布在腦干、額葉皮層、邊緣系統(tǒng)等區(qū)域。目前尚不清楚究竟是哪些部位的5-HT1A受體參與了對(duì)SE和癲癇形成的作用。有報(bào)道海馬富含5-HT1A受體且在癲癇發(fā)生發(fā)展過(guò)程中非常重要。5-HT1A受體在顳葉癲癇患者和慢性動(dòng)物模型中致癇灶、邊緣系統(tǒng)區(qū)域密度下降[4,6]，可能參與了癲癇的發(fā)生和發(fā)作機(jī)制。研究各部位5-HT1A受體在癲癇過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化可能有助

4、于明確5-HT1A受體的作用機(jī)制。但目前尚無(wú)在SE模型和慢性杏仁核模型中干預(yù)的研究，因此本研究擬通過(guò)皮下和海馬局部干預(yù)，明確5-HT1A受體對(duì)Li-pilocarpine所致SE和杏仁核慢性點(diǎn)燃模型癲癇的作用，觀察海馬5-HT1A受體是否參與其中，為癲癇的治療尋求新的靶點(diǎn)。
　　目前對(duì)5-HT1A受體表達(dá)變化的研究多為針對(duì)慢性癲癇形成的過(guò)程，而對(duì)急性SE過(guò)程中5-HT1A受體的變化未見(jiàn)有報(bào)道。細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(Extracellua

5、rsignal-regulated kinase，ERK)參與MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。已知5-HT1A受體激活在正常大鼠中能抑制ERK激活。而ERK通路在SE過(guò)程中激活后，能與下游的電壓依賴性鉀離子通道蛋白Kv4.2結(jié)合，抑制Kv4.2在CA1區(qū)神經(jīng)元突觸體和細(xì)胞膜上表達(dá)及超極化電流的形成，表現(xiàn)為促進(jìn)癲癇形成的作用[8-12]。因此，本研究擬觀察海馬和腦干5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過(guò)程中的表達(dá)變化及Li-

6、pilocarpine模型中激活5-HT1A受體后對(duì)ERK通路活化的作用，分析5-HT1A受體的相關(guān)作用機(jī)制。
　　第一部分5-HT1A受體對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)的作用目的:
　　通過(guò)皮下和海馬局部注射5-HT1A受體激動(dòng)劑或拮抗劑，觀察5-HT1A受體對(duì)Li-pilocarpine大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的作用。
　　方法:
　　1.280-300 g SD大鼠手術(shù)植入顱骨電極，術(shù)后休息7-10天，按照體重配對(duì)分為7個(gè)

7、實(shí)驗(yàn)組，分別在pilocarpine注射前1小時(shí)給予皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL/kg;組2:激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0mg/kg;組6:拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg，組7:激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0m

8、g/kg。
　　2.大鼠給予LiCl3meq/kg，22-24h后給予腹腔注射pilocarpine。記錄行為學(xué)發(fā)作GS潛伏期、GS持續(xù)時(shí)間，腦電圖上首次癇樣放電、SE潛伏期及總放電時(shí)間。腦電記錄從pilocarpine注射前半小時(shí)到后2小時(shí)為止。
　　3.雙側(cè)海馬干預(yù)大鼠給予手術(shù)植入顱骨電和微量注射導(dǎo)管(AP:-3.5 mm，L:±2.5 mm，V:-2.9mm)。術(shù)后休息7-10天。體重配對(duì)分為8-OH-DPAT組和PB

9、S組，在pilocarpine注射前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余Li-pilocarpine模型建立和腦電、行為學(xué)觀察同前。
　　結(jié)果:
　　1.腹腔給予激動(dòng)劑各組癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生率和急性死亡率未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異。
　　2.行為學(xué)觀察激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的GS發(fā)作潛伏期顯著增高，而GS發(fā)作累計(jì)持續(xù)時(shí)間較PBS組顯著降低，且1.0

10、 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
　　3.激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.5 mg/kg和1.0 mg/kg組的首次癇樣放電和SE起始潛伏期顯著增高，總放電時(shí)間較PBS組顯著降低，且1.0 mg/kg組作用效果優(yōu)于0.5 mg/kg組。
　　4.低劑量（0.01 mg/kg和0.1 mg/kg）8-OH-DPAT對(duì)行為學(xué)和腦電發(fā)作均無(wú)抑制作用。
　　5.激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組的抑制作用

11、能被拮抗劑WAY-100635有效抑制，但單純注射拮抗劑對(duì)發(fā)作無(wú)影響。
　　6.海馬干預(yù)中，8-OH-DPAT組GS持續(xù)時(shí)間較PBS組下降，但對(duì)GS和腦電圖上放電潛伏期無(wú)作用。
　　結(jié)論:
　　1.5-HT1A受體激活對(duì)Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)形成和發(fā)作有抑制作用。
　　2.皮下注射低劑量激動(dòng)劑0.01和0.1 mg/kg對(duì)Li-pilocarpine模型癲癇發(fā)作無(wú)影響。
　　3.雙側(cè)海

12、馬內(nèi)5-HT1A受體激活能抑制Li-pilocarpine模型癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作的嚴(yán)重程度，但不影響癲癇持續(xù)狀態(tài)形成過(guò)程。
　　第二部分5-HT1A受體對(duì)杏仁核點(diǎn)燃癲癇形成的作用目的:
　　通過(guò)腹腔和海馬局部給予5-HT1A受體激動(dòng)劑或拮抗劑，觀察5-HT1A受體對(duì)杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程癲癇形成的作用。
　　方法:
　　1.280-300g SD大鼠給予手術(shù)植入基底旁杏仁核電極，術(shù)后休息7-10天。大鼠測(cè)定初始后放電閾值（

13、ADT）后，每天給予大鼠1次電流刺激，刺激強(qiáng)度為ADT，共刺激16天。記錄大鼠發(fā)作等級(jí)、后放電時(shí)程（ADD）等參數(shù)。
　　2.皮下給藥大鼠按體重配對(duì)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別在每天電刺激前1小時(shí)皮下注射以下試劑:組1:磷酸鹽緩沖液(PBS)1mL/kg;組2:激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.01mg/kg;組3:8-OH-DPAT0.1 mg/kg;組4:8-OH-DPAT0.5 mg/kg;組5:8-OH-DPAT1.0 mg/kg;組6

14、:激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.0mg/kg。
　　3.海馬局部干預(yù)大鼠在手術(shù)時(shí)右側(cè)海馬植入微量注射導(dǎo)管(AP:-3.5 mm，L:-2.5 mm，V:-2.9mm)，分為8-OH-DPAT組和PBS組，在每天點(diǎn)燃前15min分別給予8-OH-DPAT1μg(1μL)和PBS1μL。其余同前。
　　結(jié)果:
　　1.皮下注射激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg

15、和0.5 mg/kg組顯著延緩杏仁核點(diǎn)燃過(guò)程發(fā)作等級(jí)的增加，1.0 mg/kg組同時(shí)縮短每天點(diǎn)燃的ADD，而且這種作用能被同時(shí)注射拮抗劑WAY-1006351.0 mg/kg抑制。
　　2.激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg組停留在1級(jí)的天數(shù)長(zhǎng)于PBS組，停留在5級(jí)的天數(shù)短于PBS組。同時(shí)，達(dá)到2、3、4、5級(jí)所需要的刺激數(shù)均多于PBS組。0.5 mg/kg組存在類似作用趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異。激動(dòng)劑1.0 mg/kg組

16、比PBS組在部分性階段（1-3級(jí)）停留更長(zhǎng)的時(shí)間，而在全面性階段（4-5級(jí)）停留時(shí)間更短，且該作用能被拮抗劑有效抑制。
　　3.激動(dòng)劑加拮抗劑組停留在4級(jí)的天數(shù)長(zhǎng)于激動(dòng)劑1.0 mg/kg組，而到達(dá)2、3、4、5級(jí)的天數(shù)明顯短于激動(dòng)劑1.0 mg/kg組，其中到達(dá)3級(jí)和4級(jí)的天數(shù)兩組間存在顯著性差異。
　　4.低劑量激動(dòng)劑0.1和0.01 mg/kg組對(duì)發(fā)作等級(jí)和ADD各指標(biāo)均無(wú)影響。
　　5.海馬局部干預(yù)與PBS組相

17、比對(duì)點(diǎn)燃過(guò)程發(fā)作等級(jí)和ADD各指標(biāo)均無(wú)影響。
　　結(jié)論
　　1.皮下注射5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT1.0 mg/kg延緩杏仁核模型點(diǎn)燃進(jìn)程，對(duì)慢性顳葉癲癇形成具有抑制作用，且這種作用在部分性癲癇階段最明顯。
　　2.皮下注射低劑量激動(dòng)劑0.01和0.1 mg/kg對(duì)杏仁核模型癲癇形成無(wú)影響。
　　3.海馬5-HT1A受體不參與對(duì)慢性癲癇形成的抑制作用。
　　第三部分癲癇持續(xù)狀態(tài)中5-HT1A受

18、體表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化及ERK通路的研究目的:
　　明確腦干和海馬5-HT1A受體在Li-pilocarpine模型SE過(guò)程中的表達(dá)變化，并觀察5-HT1A受體激活后對(duì)SE過(guò)程中ERK通路活化的作用。
　　方法:
　　1.250-300g SD大鼠建立Li-pilocarpine模型。在pilocarpine給藥后0小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，6小時(shí)和24小時(shí)留取海馬和腦干的石蠟切片標(biāo)本和蛋白組織標(biāo)本，分別用于對(duì)5-HT1A受

19、體的免疫組化和Western blot檢測(cè)。
　　2.經(jīng)微波修復(fù)后，進(jìn)行免疫組化染色。切片在顯微鏡下拍照后將圖片導(dǎo)入Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件，測(cè)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性面積和平均光密度值。
　　3.通過(guò)Western blot方法半定量檢測(cè)5-HT1A受體在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。
　　4.用于ERK通路研究的大鼠根據(jù)體重配比分為4組，組1:空白對(duì)照組:在給予氯化鋰后24小時(shí)，給予磷酸鹽緩沖液(PBS)1m

20、L/kg替代pilocarpine注射;組2:單純Li-pilocarpine模型組;組3:皮下激動(dòng)劑干預(yù)組:建立Li-pilocarpine模型，并在pilocarpine注射前1小時(shí)皮下注射激動(dòng)劑8-OH-DAPT1.0 mg/kg;組4:皮下激動(dòng)劑合并拮抗劑干預(yù)組:建立Li-pilocarpine模型，并在pilocarpine注射前1小時(shí)前皮下激動(dòng)劑8-OH-DPAT0.01mg/kg注射后即刻給予拮抗劑WAY-1006351.

21、0mg/kg注射。分別在pilocarpine給藥后0小時(shí)，1小時(shí)，2小時(shí)，6小時(shí)和24小時(shí)留取海馬蛋白標(biāo)本。
　　4.通過(guò)Western blot方法半定量檢測(cè)pERK1/2和ERK1/2在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.腦干5-HT1A受體主要表達(dá)在中縫背核（DRN）和中央上核（MRN），分布在5-HT神經(jīng)元細(xì)胞膜上，少部分在胞漿中可見(jiàn)。5-HT1A受體在pilocarpine注射后1小時(shí)表達(dá)增加，但進(jìn)入

22、SE晚期（6小時(shí)和24小時(shí)）表達(dá)減少。其中DRN受體變化的幅度大于MRN。
　　2.海馬5-HT1A受體分布在CA1區(qū)，CA3區(qū)和DG區(qū)的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞膜上，但表達(dá)濃度不高。海馬受體在pilocarpine注射后2小時(shí)表達(dá)增多，但在SE晚期期（6小時(shí)和24小時(shí)）表達(dá)下降。
　　3.Li-pilocarpine模型組pERK/ERK值顯著高于空白對(duì)照組。其中以pERK2變化為主，在整個(gè)SE過(guò)程中持續(xù)增高。而pERK1僅在S

23、E晚期升高明顯。激動(dòng)劑使pERK1/ERK1和pERK2/ERK2在SE過(guò)程各時(shí)間點(diǎn)均較低，而合并拮抗劑組該作用消失。
　　結(jié)論:
　　1.腦干中縫核區(qū)5-HT1A受體表達(dá)在pilocarpine注射后1小時(shí)升高，SE后期表達(dá)下降。DRN受體密度變化程度大于MRN。
　　2.海馬5-HT1A受體在pilocarpine注射后2小時(shí)表達(dá)增高，后期表達(dá)明顯減少。5-HT1A受體表達(dá)改變與神經(jīng)元密度變化不完全相關(guān)。