球孢白僵菌基因工程菌株構(gòu)建及殺蟲效率評價(jià).pdf

1、隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們環(huán)保意識的提高,環(huán)境友好型生物源殺蟲劑的應(yīng)用受到越來越高的重視。利用昆蟲病原真菌加工而成的真菌殺蟲劑的應(yīng)用及基礎(chǔ)研究得到了長足的發(fā)展,但由于存在擊倒昆蟲時(shí)間較長、對環(huán)境條件要求高等缺點(diǎn),真菌殺蟲劑的廣泛應(yīng)用受到限制。因此利用基因工程和細(xì)胞工程等技術(shù)提高菌株毒力,遺傳改造獲得適合市場需要的真菌殺蟲劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值。球孢白僵菌作為重要的昆蟲病原真菌在害蟲的生物防治中發(fā)揮著重要作用。本文以球孢白僵菌作為出發(fā)菌株,同

2、時(shí)引入雙價(jià)毒力基因,即降解昆蟲體壁的類枯草桿菌蛋白酶基因Pr1A和北非蝎昆蟲特異性神經(jīng)毒素多肽基因AaIT,構(gòu)建了高毒力雙價(jià)工程菌株。 本研究首先構(gòu)建了含有不同篩選標(biāo)記和目的基因的載體pGPS3Ben-Pr1A和pGPET1。并且通過對分生孢子的抑制性實(shí)驗(yàn),篩選出兩種抗性藥對球孢白僵菌的最佳抑制濃度,其中草胺磷對球孢白僵菌的最佳抑制濃度為100μg/ml,苯菌靈對球孢白僵菌的最佳抑制濃度為2μg/ml。本實(shí)驗(yàn)選用了兩種不同的遺傳

3、轉(zhuǎn)化方法對球孢白僵菌進(jìn)行遺傳改造,獲得了一價(jià)工程菌株Bb13T和Bb202T,及二價(jià)工程菌株Bb13Tpr1A。RT-PCR和Western blot結(jié)果證明,Pr1A和AaIT均在重組菌株中組成性轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。PR1A蛋白酶活性測定結(jié)果表明,超表達(dá)PR1A的二價(jià)工程菌株的酶活相對于野生型菌株得到了極大的提高。并且通過初步的注射蟲體實(shí)驗(yàn),篩選出毒力相對較高的一價(jià)工程菌株Bb13T-4-1、Bb13T-10-3和Bb202T-7,和二價(jià)工程

4、菌株Bb13TPr1A-1、Bb13TPr1A-2和Bb13TPr1A-3。對松墨天牛的生物測定結(jié)果表明,超量表達(dá)AAIT的一價(jià)工程菌株Bb202T-7提高了殺蟲效率約11.1％。使用大蠟螟(Galleria mellonella)和馬尾松毛蟲進(jìn)行生物測定的結(jié)果同樣顯示,超量表達(dá)AaIT單價(jià)基因及AaIT和pr1A雙價(jià)基因均能顯著地提高重組菌株的毒力。用大蠟螟做生測試蟲,在孢子濃度為1×107個(gè)/ml時(shí),與野生型菌株Bb13相比,超量表

5、達(dá)AaIT的重組菌株Bb13T的致死中時(shí)(LT50)平均縮短了24.4％,同時(shí)超量表達(dá)AaIT和pr1A雙價(jià)基因的Bb13TPr1A的LT50平均縮短了20.9％。馬尾松毛蟲的生物測定中,在孢子濃度為1×107個(gè)/ml時(shí),與野生型菌株Bb13相比,超量表達(dá)AaIT基因的重組菌株Bb13T的LT50平均縮短了40％,其致死中濃度(LC50)降低了約15倍的劑量；超量表達(dá)AaIT和Pr1A雙價(jià)基因的Bb13Tpr1A的LT50平均縮短了36