雞卵黃抗體免疫檢測(cè)食源性致病大腸桿菌O157：H7的研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌E.coliO157：H7是人類重要腸道致病菌之一，本研究選擇雞卵黃抗體擬實(shí)現(xiàn)對(duì)該致病菌的免疫檢測(cè)。主要通過E.coliO157：H7特征抗原的選擇、分離提取、以臨產(chǎn)蛋母雞作為免疫對(duì)象進(jìn)行免疫，收集高免蛋，取出蛋黃并經(jīng)分離純化等操作獲得雞卵黃免疫球蛋白(IgY)，選用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記特異性IgY，建立針對(duì)E.coliO157：H7特征抗原的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法，并試行設(shè)計(jì)了E.coliO157：H7免疫

2、檢測(cè)試劑盒。 特征抗原選取脂多糖(LipopoLysaccharide，LPS)和O-特異性多糖(O-specificpoLysaccharide，OSP)作為主要研究對(duì)象，采用改良熱酚水法分離提取。菌種經(jīng)革蘭氏染色、鞭毛染色及直接ELISA等鑒定血清型后，富集培養(yǎng)，3500r/min離心分離菌體并懸浮于無熱源水中，與等量90％苯酚共加熱至60℃后混合攪拌30min，冰浴至2℃，3500r/min離心20min，收集水相置于透析

3、袋中透析60小時(shí)以上去酚，濃縮得LPS粗品。加DNase和RNase37℃酶解4h，100℃水浴10min，冷卻至室溫后1500r/min離心30min取上清，加丙酮沉淀獲得純化LPS。15g濕菌體提取后，經(jīng)多糖、核酸、蛋白及鱟試劑凝集活性檢測(cè)可獲得75mg純化LPS，提取率為0.5％。 純化的LPS在1.5％醋酸中100℃水浴30min，1500r/min離心10min，取上清4℃下透析24h去酸，濃縮得OSP抗原。LPS、O

4、SP及熱滅活E.coliO157：H7與不完全弗氏佐劑充分混合制得LPS(120μg/mL)抗原、OSP(200μg/mL)抗原及菌體(108-109CFU/mL)抗原。 以上三種抗原對(duì)臨產(chǎn)母雞按每只雞每次1mL劑量進(jìn)行免疫，間隔15天，免疫四次。收集雞蛋，應(yīng)用間接ELISA監(jiān)測(cè)卵黃抗體(IgY)產(chǎn)生，在免疫后35天抗體效價(jià)達(dá)到最高值，在60天時(shí)抗體效價(jià)明顯下降，可持續(xù)至80天左右。 卵黃抗體的分離純化采用微濾、超濾、鹽

5、析沉淀及離子交換方法。水稀微濾除脂，5萬截流分子量超濾膜超濾濃縮，45％硫酸銨鹽析沉淀得IgY粗品，0.8％PBS溶解，DEAE-SephadexA-50離子交換層析，pH7.0THS緩沖液，0.05mol/L平衡上樣，0.135mol/L洗脫雜蛋白，0.185mol/L洗脫分離純化IgY。SDS-PAGE和直接ELISA檢測(cè)，達(dá)電泳純，凍干IgY稀釋至2.5mg/mL的抗體亦具有反應(yīng)活性。 卵黃抗體的酶標(biāo)記選用辣根過氧化物酶，

6、采用改良過碘酸鈉法。酶標(biāo)抗體經(jīng)效價(jià)、酶活性等測(cè)定，確定的最佳條件為：HRP與IgY質(zhì)量比為1∶2，NaIO4濃度為0.10mol/L，室溫條件下反應(yīng)2小時(shí)。 基于實(shí)驗(yàn)所得抗體初步設(shè)計(jì)了E.coliO157：H7雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)試劑盒。用10μg/mLIgY-antiOSP包被聚苯乙烯酶標(biāo)板，酶標(biāo)抗體(HRP-IgY-antiOSP)工作濃度為1：320。試劑盒性能評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：E.coliO157：H7的最低檢出量為1