c-Maf泛素化及其泛素連接酶的研究.pdf

1、第一部分篩選c-Maf關(guān)鍵泛素化位點(diǎn)
　　目的:
　　利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建c-Maf的賴氨酸位點(diǎn)突變體，結(jié)合各突變體對(duì)蛋白酶體抑制劑硼替佐咪的不同反應(yīng)，篩選關(guān)鍵突變位點(diǎn)，確定各賴氨酸位點(diǎn)對(duì)c-Maf泛素化的影響。
　　方法:
　　1.通過定點(diǎn)突變PCR技術(shù)將c-Maf蛋白質(zhì)的賴氨酸突變?yōu)榫彼?K→R），得到c-Maf單一賴氨酸突變位點(diǎn)(例如K29R)和M14（全突變體）以及多突變體;同時(shí)構(gòu)建c-Maf含單一賴氨

2、酸的突變體（例如K29），然后將各突變體分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，36 hrs后加入蛋白酶體抑制劑硼替佐咪(BZ)，進(jìn)一步處理12 hrs，然后用Western blotting方法檢測(cè)各突變體對(duì)c-Maf穩(wěn)定性的影響，并進(jìn)一步篩選出可以介導(dǎo)c-Maf泛素化的關(guān)鍵賴氨酸位點(diǎn)。
　　2.將篩選的關(guān)鍵突變體及野生型和全突變體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，6 hrs后加入蛋白酶體抑制劑MG132處理4hrs，用免疫沉淀法檢測(cè)各突變體

3、對(duì)c-Maf泛素化水平的影響。
　　3.將關(guān)鍵突變體及野生型和全突變體構(gòu)建到pEGFP-C3中，36 hrs后乙醇固定并用DAPI染核，用激光共聚焦檢測(cè)c-Maf的胞內(nèi)分布。
　　4.將關(guān)鍵突變體及野生型和全突變體同CCND2-Luc共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中，36 hrs后檢測(cè)其對(duì)熒光素酶活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.c-Maf單點(diǎn)突變無法抑制c-Maf的泛素化降解，同時(shí)單一賴氨酸的存在也不能單獨(dú)介導(dǎo)c-

4、Maf的泛素化降解。多個(gè)賴氨酸的存在，例如同時(shí)保留第85位和350位賴氨酸位點(diǎn)K(85，350)可以介導(dǎo)c-Maf的泛素化降解。
　　2.IP結(jié)果顯示K(85，350)的c-Maf突變體有明顯的多聚泛素化條帶，但這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變的多位點(diǎn)突變體也存在多聚泛素化條帶，證明這兩個(gè)位點(diǎn)參與c-Maf泛素化，但也不是唯一的。
　　3.共聚焦結(jié)果顯示K(85，350)（同時(shí)保留85位與350位賴氨酸）、K(85，350)R（同時(shí)突變8

5、5位與350位賴氨酸）突變體同野生型c-Maf一樣主要分布在核內(nèi)，而完全突變體在核內(nèi)和胞質(zhì)中均有分布，提示c-Maf部分賴氨酸位點(diǎn)突變不影響其胞內(nèi)定位，而完全突變可能由于泛素化修飾的改變導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)分布的變化。
　　4.熒光素酶活性結(jié)果顯示，K(85，350)、K(85，350)R多位點(diǎn)突變體以及全突變體相比野生型c-Maf能明顯增強(qiáng)CCND2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，這可能與c-Maf蛋白的降解受到抑制有關(guān)。
　　小結(jié):
　

6、　c-Maf的泛素化是由多個(gè)賴氨酸位點(diǎn)介導(dǎo)的，例如c-Maf蛋白中K85和K350對(duì)于其泛素化很重要，但它們并不是唯一的。K(85，350)和K(85，350)R多突變體不影響蛋白在細(xì)胞中的定位，但由于其降解受到一定程度的抑制，可明顯增強(qiáng)其對(duì)CCND2的轉(zhuǎn)錄活性。
　　第二部分c-Maf的溶酶體降解途徑
　　目的:
　　全突變c-Maf(M14)突變體的泛素化降解被抑制，但在實(shí)驗(yàn)中仍發(fā)現(xiàn)其發(fā)生降解，由于蛋白質(zhì)主要存蛋白

7、酶體和溶酶體兩種降解途徑，我們推測(cè)c-Maf可能也通過溶酶體降解。本部分將利用不同的溶酶體抑制劑和蛋白酶體抑制劑抑制蛋白質(zhì)降解，以證明c-Maf在泛素化降解的同時(shí)也存在著溶酶體降解。
　　方法:
　　1.轉(zhuǎn)染W(wǎng)T與M14 c-Maf質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中，用放線菌酮(CHX,100ng/mL)處理細(xì)胞不同時(shí)間(0、4、8、12 hrs)后，收取細(xì)胞進(jìn)行Western Blotting分析，檢測(cè)蛋白的變化情況。
　　

8、2.轉(zhuǎn)染W(wǎng)T與M14 c-Maf質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中，加入放線菌酮(CHX100ng/mL)抑制蛋白合成，同時(shí)加入蛋白酶體抑制劑硼替佐咪(1μM)，以及溶酶體抑制劑氯喹（100μM）和氯化銨(1 mM)進(jìn)行處理，12 hrs后檢測(cè)蛋白的變化。
　　結(jié)果:
　　1.在0～8 hrs，WT-c-Maf降解明顯，M14全突變降解不明顯，而在8～12 hrs間M14開始發(fā)生了明顯的降解，證明M14仍存在另一種降解方式。

9、　　2.野生型c-Maf在加入蛋白酶體抑制劑和溶酶體抑制劑后都可以抑制其降解，同時(shí)加入抑制效果更明顯，而全突變體M14只有在加入溶酶體抑制劑后才能抑制其降解，同時(shí)加入溶酶體和蛋白酶體抑制劑后抑制效果與單加溶酶體抑制劑效果相同。
　　小結(jié):c-Maf可以通過蛋白酶體和溶酶體兩種方式降解。
　　第三部分c-Maf的E3泛素連接酶的篩選和確證
　　目的:
　　上述研究表明c-Maf可以發(fā)生多聚泛素化，但其蛋白泛素化體系

10、還不清楚。本部分利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的E3篩選系統(tǒng)，結(jié)合LC/MS/MS及免疫共沉淀技術(shù)篩選c-Maf的泛素連接酶E3，利用Western Blotting和熒光共定位對(duì)篩選的E3進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　方法:
　　1.將實(shí)驗(yàn)室保存的E3表達(dá)文庫(kù)中的E3s質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到NIH3T3/c-Maf+CCND2-luc細(xì)胞（穩(wěn)定表達(dá)c-Maf和CCND2-1uc的NIH3T3細(xì)胞）中，48 hrs后檢測(cè)熒光素酶活性變化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，初步篩選出

11、可能的泛素連接酶。
　　2.將篩選出的E3s與c-Maf質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到NIH3 T3/c-Maf+CCND2-1uc細(xì)胞中，Western Blotting檢測(cè)c-Maf蛋白的變化情況，進(jìn)一步篩選c-Maf的泛素連接酶。
　　3.轉(zhuǎn)染不同量的cMul質(zhì)粒到NIH3T3/c-Maf+CCND2-1uc細(xì)胞中，WesternBlotting檢測(cè)cMul與c-Maf的相關(guān)性。
　　4.為了進(jìn)一步確定c-Maf的泛素化酶體系，我

12、們采用親和-免疫沉淀偶聯(lián)蛋白質(zhì)譜學(xué)分析策略從蛋白質(zhì)組的角度來證實(shí)c-Maf的泛素化連接酶。具體方法:共轉(zhuǎn)染HA-c-Maf與Ub質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中，用MG132處理細(xì)胞2hrs后，以Anti-HA agarose微珠進(jìn)行IP，獲得anti-HA的免疫復(fù)合物，經(jīng)純化，還原一系列步驟后，得到的蛋白質(zhì)用胰蛋白酶消化以得到多肽，得到的多肽混合物經(jīng)C18過柱純化后，應(yīng)用于LC/MS/MS分析。各樣品先經(jīng)液相色譜分離，各分離組分迸一步經(jīng)串聯(lián)

13、質(zhì)譜分析(LC/MS/MS)，得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)SEQUEST和GPM Algorithm方法分析各多肽順序。最后用Scaffold軟件識(shí)別各蛋白質(zhì)順序，與蛋白質(zhì)質(zhì)譜學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，從而得到細(xì)胞中與c-Maf共沉淀的相互作用蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)進(jìn)一步經(jīng)DAVID3.0和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Clustering路徑分析，得到c-Maf泛素化相關(guān)蛋白質(zhì)。
　　5.泛素化酶cMul與c-Maf的相互作用分析:共轉(zhuǎn)染HA-c-Maf、 Ub及

14、構(gòu)建的Flag-cMul質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞中，36 hrs后加入MG132處理4 hrs，分別用Anti-Ub agarose beads和Anti-Flag agarose beads進(jìn)行co-IP，利用Western Blotting檢測(cè)c-Maf和cMul的共沉淀情況。
　　6.共轉(zhuǎn)染構(gòu)建的pEGFP-c-Maf與Flag-cMul到HEK293T細(xì)胞中，用Flag抗體做免疫熒光，結(jié)合EGFP-c-Maf本身表達(dá)的綠色

15、熒光蛋白，于激光共聚焦顯微鏡分析蛋白的是否存在共定位情況。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù)熒光素酶活性的變化情況，初步篩選出16個(gè)E3基因。
　　2.進(jìn)一步從16個(gè)E3中，篩選出泛素連接酶cMul。
　　3.串聯(lián)質(zhì)譜分析(LC/MS/MS)結(jié)果顯示c-Maf與cMul存在相互作用，且發(fā)現(xiàn)了其他幾種泛素化相關(guān)的蛋白。
　　4.共沉淀與熒光共定位結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了c-Maf與cMul有相互作用，而且cMul促進(jìn)了c-M

16、af的泛素化降解。
　　小結(jié):
　　篩選出c-Maf的E3泛素連接酶cMul，并在體外證實(shí)了該酶有促進(jìn)c-Maf泛素化降解的作用。
　　結(jié)論：
　　本研究通過定點(diǎn)突變構(gòu)建了一系列c-Maf的賴氨酸突變體，證明了c-Maf的泛素化不依賴于單個(gè)賴氨酸位點(diǎn)，并找到兩個(gè)重要的賴氨酸位點(diǎn)K85和K350可以介導(dǎo)c-Maf的泛素化，但是同時(shí)發(fā)現(xiàn)僅突變這兩個(gè)賴氨酸位點(diǎn)不能阻斷c-Maf的泛素化，說明c-Maf的泛素化由多位點(diǎn)介