問號(hào)狀賴型鉤端螺旋體LAg42膜蛋白基因的克隆表達(dá)及功能研究.pdf

1、鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體感染引起的一種人獸共患病，它在世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著人類的健康。我國(guó)是鉤體病疫情較為嚴(yán)重的國(guó)家，鉤體病的防治是一項(xiàng)重要的任務(wù)。目前，在鉤體病的治療上已取得重大進(jìn)展，但對(duì)其致病機(jī)制及免疫分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)還不甚清楚，現(xiàn)有的預(yù)防性疫苗亦僅能產(chǎn)生短期的、不完全的免疫保護(hù)效應(yīng)。鉤體菌型復(fù)雜，僅致病性鉤體就有超過230種血清型，這種血清型的多樣性主要是由于LPS碳水化合物成分的差異性引起的<'[1]>。雖然鉤體

2、LPS有一定的免疫保護(hù)性，但不同的血清型具有不同的LPS成分<'[1]>，所以以LPS成分研制的疫苗難以產(chǎn)生完全性保護(hù)作用。然而研究表明，致病性鉤體蛋白提取物可以對(duì)多種血清型鉤體的感染產(chǎn)生廣泛的交叉保護(hù)作用<'[2]>，是潛在的侯選疫苗，如LipL32(也被稱作Hapl)，LipL41和OmpL1已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生保護(hù)性效應(yīng)，證明它們是各種致病性鉤體中的保護(hù)蛋白<'[3,4]>。 最近，Nobuo Koizumi等用全鉤抗血清結(jié)合

3、Western blotting的方法在L.manilae UP-MMC菌株基因組中發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白抗原LAg42，并預(yù)測(cè)它可能是鉤端螺旋體的毒力因子，可以引起保護(hù)性免疫反應(yīng)<'[5]>，但尚未對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。我們以賴型鉤體中編碼IAg42膜蛋白的基因?yàn)閷?duì)象，對(duì)其進(jìn)行克隆分析，進(jìn)行原核及真核表達(dá)，及LAg42膜蛋白的功能研究。 本研究首先以問號(hào)狀賴型鉤體017株、56601株及雙曲鉤體PatocⅠ株基因組為模板，以PCR擴(kuò)增

4、目的基因，構(gòu)建Lag42基因與質(zhì)粒載體pET-32 a(+)的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-lag42，克隆篩選并測(cè)序；并利用Dnaman、NCBI及SignalP等生物信息資源對(duì)其進(jìn)行序列分析；最后對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，分離純化融合蛋白后制備多價(jià)抗體，并用XTT、法和流式細(xì)胞儀對(duì)純化的LAg42膜蛋白進(jìn)行初步的功能研究。同時(shí)，構(gòu)建Lag42與：pcDNA3.1A<'+>的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1A<'+>-lag42；并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)p

5、cDNA3.1-Loa22轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)其表達(dá)情況。 研究結(jié)果顯示不同毒力賴型鉤體均能擴(kuò)增出目的片段，而Patoc Ⅰ株則未能擴(kuò)增出目的片段。序列分析顯示不同賴型鉤體Lag42基因的同源性很高，pET-lag42轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21后，表達(dá)出分子量約為62kDa的LAg42融合蛋白，在適當(dāng)?shù)臈l件下，融合蛋白在菌體內(nèi)主要以可溶性方式(非包涵體)表達(dá)，經(jīng)親和層析純化，獲得高純度的LAg42融合蛋白，XTT和流式