塔斯品堿及其衍生物對乳腺癌生長的抑制作用及分子機制研究.pdf

1、乳腺癌是一種是危害女性健康最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率、死亡率高等特點。目前，藥物干預是乳腺癌的主要治療方法，近年來抗乳腺癌藥物開發(fā)取得了較大的進展，然而由于乳腺癌發(fā)病機制的復雜性和演變的不可預知性，還尚未尋找出有效的預防和治愈乳腺癌的方法。因此，不斷研究開發(fā)新型的抗乳腺癌藥物顯得尤為重要。由于天然植物中所含成分多樣，化學結構新穎，從天然植物中尋找活性成分，大規(guī)?？焖俸Y選具有抗腫瘤活性的先導化合物，通過化學結構的修飾與改造，得到低毒

2、、高效的新型藥物是當今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)的熱點。
　　塔斯品堿是本實驗室采用細胞膜色譜模型首次從陜西秦巴山區(qū)特有藥用植物紅毛七中篩選得到的化合物，具有多種藥理活性，能夠抑菌、抗炎、促進傷口愈合，抑制S180肉瘤生長。本研究通過體外和體內實驗考察了塔斯品堿及其結構修飾后的衍生物HMQ1611對乳腺癌生長的影響，并對其作用機制進行了系統(tǒng)研究，旨在為開發(fā)新型的抗乳腺癌藥物提供依據(jù)。本研究的主要內容和結果包括以下幾個方面：
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3、.塔斯品堿對乳腺癌的抑制作用
　　體外培養(yǎng)乳腺癌細胞ZR-75-30，采用MTT法考察了塔斯品堿對乳腺癌細胞活力的影響，流式細胞術檢測塔斯品堿對細胞周期和凋亡的影響，western blotting和RT-PCR測定塔斯品堿對ERα及其相關受體PR mRNA和蛋白表達的影響，結果表明，塔斯品堿能夠抑制乳腺癌細胞增殖，阻滯細胞周期于 S期，誘導細胞凋亡，下調 ERα和PR表達。建立了ZR-75-30裸鼠移植瘤模型，對塔斯品堿的體內抗

4、乳腺癌作用進行了驗證，塔斯品堿連續(xù)給藥后顯著抑制了腫瘤的生長。
　　建立了利用 HPLC-MS檢測塔斯品堿作用后兩種 EGFR高表達細胞，A431和HEK293/EGFR細胞內和細胞外塔斯品堿的含量的方法，并結合建立的兩種細胞的細胞膜色譜模型研究了塔斯品堿和EGFR的相互作用，然后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和實時熒光定量多聚酶鏈反應（real-time PCR）考察了塔斯品堿對EGFR mRNA和蛋白表達的影響。結果顯示，

5、隨著塔斯品堿作用濃度的增加，進入細胞的藥物濃度相應增加，塔斯品堿可以作用于細胞膜上的EGFR，抑制細胞 EGFR的表達。以上結果說明塔斯品堿通過下調ERα和EGFR的表達，抑制乳腺癌的生長。
　　2.塔斯品堿衍生物HMQ1611對乳腺癌的抑制作用
　　采用 MTT法考察 HMQ1611對四種乳腺癌細胞活力的影響，流式細胞儀檢測HMQ1611對細胞周期和凋亡的影響，并運用 siRNA干擾和質粒 DNA瞬時轉染驗證HMQ1611

6、是否以ERα為作用靶點。結果表明，HMQ1611能夠抑制四種乳腺癌細胞的增殖，阻滯細胞周期于S期，誘導細胞凋亡。HMQ1611對ERα陽性乳腺癌細胞的抑制作用優(yōu)于對ERα陰性乳腺癌細胞，采用siRNA干擾的方法沉默ZR-75-30細胞中ERα表達后，與對照組相比，抑制作用降低，而向 MDA-MB-231細胞中轉染 ERα后，與對照組相比，抑制作用增強，說明ERα是HMQ1611的作用靶點。
　　采用western blotting

7、和real-time PCR檢測HMQ1611對ERα和EGFR信號通路的影響，結果顯示，HMQ1611能夠下調ERα的mRNA和蛋白表達，抑制E2激活的MAPK通路，降低 EGFR磷酸化水平及其下游信號級聯(lián)反應 MAPK和PI3K/Akt，說明HMQ1611通過下調ERα mRNA和蛋白表達，阻斷E2的基因組通路和膜ERα所介導的E2激活的MAPK通路，同時抑制EGFR的活性，繼而阻斷其下游的信號級聯(lián)MAPK和PI3K/Akt通路。<

8、br>　　建立了ZR-75-30裸鼠移植瘤模型驗證HMQ1611的體內抑瘤活性，發(fā)現(xiàn)HMQ1611能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的體積和瘤重，并且在整個實驗過程中，與對照組相比HMQ1611給藥組小鼠的體重與對照組相比沒有降低，同時也無其他異?，F(xiàn)象發(fā)生。
　　3.塔斯品堿衍生物HMQ1611對乳腺癌細胞轉移的抑制作用
　　采用Millicell小室模型和劃痕實驗模型考察了HMQ1611對乳腺癌細胞粘附、遷移和侵襲的影響，采用明膠酶譜

9、法和western blotting實驗檢測了細胞中MMP-2和MMP-9活性和蛋白表達的影響。結果表明，HMQ1611可以抑制乳腺癌細胞粘附、遷移和侵襲能力，其作用機制是通過抑制MMP-2和MMP-9活性和蛋白表達，抑制了乳腺癌細胞的轉移。
　　綜上所述，塔斯品堿能夠顯著抑制乳腺癌的生長，可以作為新型的抗乳腺癌先導化合物。對塔斯品堿結構優(yōu)化得到的塔斯品堿衍生物 HMQ1611能夠抑制乳腺癌細胞的侵襲，同時通過作用于ERα和EGF