水飛薊賓對乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用研究.pdf

1、目的:Twist基因在惡性腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)中發(fā)揮重要作用。本研究選用MDA-MB-231和4T1乳腺癌細(xì)胞系和小鼠乳腺癌肝肺轉(zhuǎn)移模型，研究Twist基因和EMT相關(guān)標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin)和E鈣粘蛋白(E-cadherin)在體內(nèi)外的表達(dá)，探討水飛薊賓是否是通過影響Twist基因的表達(dá)來調(diào)控MDA-MB-231和4T1乳腺癌細(xì)胞系發(fā)生EMT，

2、進(jìn)而明確其對惡性乳腺癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法:
　　1.體外實驗:采用具有高轉(zhuǎn)移性的MDA-MB-231和4T1細(xì)胞研究水飛薊賓對兩乳腺癌細(xì)胞EMT的影響。培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1，采用MTT法檢測水飛薊賓對細(xì)胞增殖能力的影響;通過細(xì)胞劃痕實驗檢測水飛薊賓對細(xì)胞遷移能力的影響，采用Transwell小室法檢測水飛薊賓對細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響，分別采用RT-PCR與Weste

3、rn blot檢測水飛薊賓對乳腺癌細(xì)胞Twist基因與E鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)水平的影響。
　　2.體內(nèi)實驗:在BABL-c小鼠第四乳腺對接種4T1細(xì)胞建立乳腺癌肝肺轉(zhuǎn)移模型。根據(jù)腫瘤的體積分層后，將小鼠隨機(jī)分成空白對照組、水飛薊賓低劑量組(50mg/kg)、中劑量組（100mg/kg）、高劑量組（200mg/kg），每組8只。水飛薊賓經(jīng)腹腔注射，每天一次，連續(xù)兩周，空白對照組給予同等體積的生理鹽水。末次給藥的次日取腫瘤及肝、肺組

4、織，通過瘤體積與瘤重評價水飛薊賓對移植瘤生長的影響，通過肉眼觀察和常規(guī)HE染色檢測水飛薊賓對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，采用Western Blot檢測水飛薊賓對E鈣粘蛋白和波形蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.體外實驗:MTT檢測結(jié)果顯示不同濃度水飛薊賓(25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)干預(yù)后，50-200μg/ml范圍內(nèi)的水飛薊賓可以不同程度地抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細(xì)

5、胞4T1的增殖，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。根據(jù)MTT檢測結(jié)果，其余細(xì)胞實驗均選擇50-200μg/ml范圍內(nèi)的水飛薊賓干預(yù)細(xì)胞24h進(jìn)行檢測。細(xì)胞劃痕和Transwell小室法實驗結(jié)果均顯示，水飛薊賓干預(yù)后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移與侵襲能力均減弱，且隨藥物劑量的增大而更弱，對4T1細(xì)胞而言，劃痕實驗?zāi)鼙砻魉w薊賓可以抑制該細(xì)胞的遷移，但是在Tranwell遷移與侵襲實驗中對照組和各用藥組的4T1細(xì)胞均不能透過Transwell的微

6、孔膜。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，4T1細(xì)胞經(jīng)不同濃度水飛薊賓干預(yù)后，與對照組相比，Twist基因的相對表達(dá)量均降低（*p＜0.05）。同樣的MDA-MB-231細(xì)胞，在藥物干預(yù)后，Twist基因的相對表達(dá)量也不同程度的降低(p＜0.05)，于高劑量時降低的最為顯著。Western Blot檢測結(jié)果顯示，水飛薊賓干預(yù)后，兩細(xì)胞E鈣粘蛋白相對表達(dá)量較對照組明顯上調(diào)(p＜0.05)，波形蛋白相對表達(dá)量顯著下調(diào)(p＜0.05)。
　　2.

7、體內(nèi)實驗結(jié)果:腹腔注射低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)劑量的水飛薊賓干預(yù)小鼠后，各組的平均瘤重為2.11±0.37g，1.37土0.21g和1.45±0.15g，對照組的平均瘤重為2.18±0.31g，低劑量組與對照組相比瘤重沒有差異，而中高劑量組與對照組相比瘤重有顯著性差異(p＜0.05)。與對照組相比，各給藥組小鼠的瘤體積明顯變小(p＜0.05)，說明水飛薊賓能夠抑制4T1移植瘤的生長。水飛薊賓(

8、50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg)干預(yù)后，肉眼觀察肝肺表面轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)數(shù)，藥物組肝表面結(jié)節(jié)數(shù)分別為:7.09±0.11個，4.76±0.37個，1.03±0.23個，與對照組10.81±0.15個相比，均有顯著性差異(p＜0.05);而各藥物組的肺結(jié)節(jié)數(shù)分別為:9.24±0.28個，6.58±0.19個，2.21±0.13個，與對照組13.72±0.26個相比，均有顯著性差異(p＜0.05);常規(guī)HE染色可看出各藥物組轉(zhuǎn)