miR-542-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、卵巢癌（Ovarian cancer）是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其死亡率居女性生殖道惡性腫瘤的首位。因卵巢癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，早期無(wú)明顯臨床癥狀，70％以上的患者在腫瘤進(jìn)展為中晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。由于目前尚缺乏早期篩查和診斷措施，其5年存活率僅30%。因此，我們迫切的需要了解卵巢癌的發(fā)生機(jī)制，尋找一種能夠早期診斷或有效治療卵巢癌的方法。MicroRNA(miRNA)是新發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小非編碼RNA，其通過(guò)

2、直接降解靶mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯來(lái)負(fù)性調(diào)控其對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)。miRNA參與了細(xì)胞的增殖，分化，生長(zhǎng)代謝以及凋亡等生物進(jìn)程，與腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展聯(lián)系密切。越來(lái)越多的證據(jù)表明，大量miRNA在人類(lèi)卵巢癌組織中異常表達(dá)，其參與了卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，并發(fā)揮重要作用。這些表達(dá)異常的miRNA有可能成為卵巢癌早期診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后的疾病標(biāo)志物，并且有可能成為卵巢癌的治療靶點(diǎn)。因此，對(duì)于miRNA和卵巢癌相關(guān)性的研究具有十分重要的意義和價(jià)值。近年來(lái)

3、有文獻(xiàn)報(bào)道，漿液性卵巢癌并非起源于正常的卵巢組織，而是來(lái)源于輸卵管上皮。本研究小組前期通過(guò)miRNA芯片技術(shù)篩選漿液性卵巢癌和正常輸卵管傘端上皮組織中差異性表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-542-5p在漿液性卵巢癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，差異倍數(shù)達(dá)25倍，表明它可能參與了漿液性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，miR-542-5p在多種腫瘤組織中表達(dá)異常，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)對(duì)其與卵巢腫瘤相關(guān)性的報(bào)道。為了進(jìn)一步明確miR-54

4、2-5p在卵巢癌中的表達(dá)，并初步了解卵巢癌發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制，本研究將對(duì)其在卵巢癌組織中的表達(dá)進(jìn)行大樣本的PCR驗(yàn)證、對(duì)卵巢癌細(xì)胞系的相關(guān)生物學(xué)行為的影響等問(wèn)題進(jìn)行初步探討，初步預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其作用的下游靶基因。
　　目的：
　　1.檢測(cè)miR-542-5p在漿液性卵巢癌中的表達(dá)情況，并分析miR-542-5p的表達(dá)與漿液性卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探討其意義。
　　2.探討miR-542-5p對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV

5、3的增殖、遷移、侵襲、凋亡等惡性生物學(xué)行為的影響。
　　3.預(yù)測(cè)并驗(yàn)證其作用的靶基因，進(jìn)一步明確miR-542-5p在漿液性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析100例漿液性卵巢癌組織及50例正常輸卵管傘端組織中miR-542-5p的表達(dá)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2.將miR-542-5p mimics、mimics NC(mimics陰性對(duì)照)轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞S

6、KOV3。采用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-542-5p對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。
　　3.通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出miR-542-5p可能作用的靶基因，并采用RT-PCR、Western-blot技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分別進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　1.漿液性卵巢癌組織中miR-542-5p的表達(dá)顯著低于正常輸卵管傘端組織（P＜0.05)。miR-54

7、2-5p的表達(dá)與漿液性卵巢癌各臨床病理特征之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　2.過(guò)表達(dá)miR-542-5p后，SKOV3細(xì)胞的增殖能力較陰性對(duì)照和正常SKOV3細(xì)胞明顯降低（P＜0.05）；transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，過(guò)表達(dá)miR-542-5p后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力較陰性對(duì)照組明顯下降（P＜0.05）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-542-5p后，SKOV3細(xì)胞的凋亡率較陰性對(duì)照組升高，而對(duì)細(xì)胞周期無(wú)影

8、響。
　　3.通過(guò)多種軟件預(yù)測(cè)，選取了miR-542-5p可能作用的靶基因?yàn)閅whab。RT-PCR分析結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-542-5p后，SKOV3細(xì)胞中Ywhab的含量較陰性對(duì)照和正常SKOV3細(xì)胞明顯降低；Western-blot技術(shù)分析結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染了miR-542-5p類(lèi)似物的細(xì)胞中，Ywhab蛋白的表達(dá)較陰性對(duì)照降低；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示：miR-542-5p能夠抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒的熒光素酶活性，

9、而對(duì)其對(duì)照組和含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.miR-542-5p可能作為抑癌基因參與了漿液性卵巢癌的發(fā)生，對(duì)于卵巢癌的早期診斷及治療具有潛在意義。
　　2.過(guò)表達(dá)miR-542-5p可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3的體外增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)凋亡。提示miR-542-5p在卵巢癌惡性生物學(xué)進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。
　　3.Ywhab有可能是miR-542-5p作用的靶基因之一，miR-542