miR-134與卵巢癌耐藥的關(guān)系及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先通過體外實(shí)驗(yàn)在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌細(xì)胞系分別過表達(dá)及抑制miR-134表達(dá)，明確其對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇的敏感性及生物學(xué)行為的影響。在前期篩選出Pak2為miR-134靶基因的基礎(chǔ)上，通過免疫組化和Western blot方法在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中檢測(cè)Pak2蛋白表達(dá)，證明Pak2蛋白表達(dá)與卵巢漿液性癌化療耐藥的關(guān)系。通過基因轉(zhuǎn)染和熒光素酶報(bào)告基因等技術(shù)明確miR-134對(duì)Pak2的結(jié)合作用及轉(zhuǎn)

2、錄后調(diào)控;明確miR-134負(fù)向調(diào)控Pak2對(duì)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇的敏感性及生物學(xué)行為的影響;進(jìn)一步明確miR-134通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Pak2基因促進(jìn)Bad的Ser112及Ser136位點(diǎn)的磷酸化機(jī)制。qRT-PCR方法檢測(cè)卵巢漿液性癌組織中Pak2 mRNA表達(dá)，分析其表達(dá)與miR-134表達(dá)的相關(guān)性。通過免疫組化和Western blot方法檢測(cè)化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中Sirt1蛋白表達(dá)情況并證實(shí)Sirt1表達(dá)與卵巢漿液性癌化療耐

3、藥的關(guān)系;在此基礎(chǔ)上應(yīng)用ChIP、qRT-PCR技術(shù)初步明確在化療耐藥卵巢癌細(xì)胞中Sirt1對(duì)miR-134的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)作用。qRT-PCR方法檢測(cè)卵巢漿液性癌組織中Sirt1 mRNA表達(dá)，分析其表達(dá)與miR-134表達(dá)的相關(guān)性。本研究通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織與細(xì)胞中miR-134、Pak2、Sirt1表達(dá)以及與耐藥的關(guān)系，旨在闡明miR-134調(diào)控Pak2在卵巢癌耐藥中的作用，并明確Sirt

4、1調(diào)節(jié)miR-134表達(dá)在卵巢癌細(xì)胞耐藥形成的重要作用和分子機(jī)制，為卵巢癌化療耐藥研究提供新的靶基因和及研究思路。
　　方法：
　　1、MiR-134與卵巢癌耐藥的關(guān)系及其作用研究
　　利用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-134在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織及細(xì)胞系中的差異表達(dá)。在SKOV3-TR30細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染miR-134 mimic外源性升高miR-134表達(dá)（miRNA mimic NC為對(duì)照組），CCK-8

5、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-134表達(dá)改變前后細(xì)胞增殖抑制率的變化;AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-134表達(dá)改變前后細(xì)胞凋亡能力的變化。研究miR-134在卵巢漿液性癌細(xì)胞紫杉醇耐藥中的作用。
　　2、MiR-134調(diào)控Pak2與Pak2磷酸化Bad蛋白在卵巢癌耐藥中的作用及其機(jī)制研究
　　通過免疫組化及Western blot方法檢測(cè)Pak2在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析Pak2表達(dá)與

6、卵巢漿液性癌組織化療耐藥的關(guān)系及與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系。構(gòu)建PMIR-Pak2及其突變質(zhì)粒PMIR-Pak2-mut，熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè)miR-134對(duì)PMIR-Pak2報(bào)告基因的結(jié)合抑制作用，qRT-PCR及Western blot方法證明miR-134對(duì)Pak2在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。在耐紫杉醇卵巢癌SKOV3-TR30細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Pak2 siRNA，紫杉醇作用后，應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Pak2抑制表達(dá)后細(xì)胞增殖

7、抑制率的變化，AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力的變化。
　　3、在卵巢癌耐藥中Sirt1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)miR-134的作用研究
　　免疫組化方法及Western blot方法檢測(cè)Sirt1在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，分析Sirt1表達(dá)與卵巢漿液性癌組織化療耐藥的關(guān)系及與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系。ChIP證明Sirt1對(duì)miR-134上游調(diào)控序列具有結(jié)合作用;進(jìn)一步分別于SKOV3細(xì)

8、胞外源性過表達(dá)Sirt1、于SKOV3-TR30細(xì)胞中抑制Sirt1表達(dá)，應(yīng)用real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-134在耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、MiR-134與卵巢癌耐藥的關(guān)系及其作用研究
　　利用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-134在卵巢漿液性癌化療耐藥與敏感組織及細(xì)胞系中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示與化療敏感組相比化療耐藥組中miR-134表達(dá)顯著降低0.6488±0.202

9、8(P=0.0098)。MiR-134在耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞SKOV3-TR30細(xì)胞中表達(dá)較SKOV3細(xì)胞中顯著下調(diào)，將SKOV3細(xì)胞中miR-134表達(dá)水平定位1，在耐紫杉醇卵巢癌SKOV3-TR30細(xì)胞中miR-134顯著低表達(dá)為0.3981±0.03562(P=0.003)。SKOV3-TR30細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic后相比轉(zhuǎn)染miRNA mimic NC組miR-134表達(dá)顯著升高(P=0.008)。通過在SKOV3-TR

10、30細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic(miRNA mimic NC為對(duì)照組)后，CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖抑制率的變化。
　　2、MiR-134調(diào)控Pak2與Pak2磷酸化Bad蛋白在卵巢癌耐藥中的作用及其機(jī)制研究
　　免疫組化及Western blot方法證明Pak2在化療耐藥卵巢漿液性癌組織和細(xì)胞中表達(dá)較敏感組織和細(xì)胞顯著升高，免疫組化實(shí)驗(yàn)證明Pak2在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中以細(xì)胞漿表達(dá)為主。Pak2表

11、達(dá)與卵巢漿液性癌組織化療與卵巢癌患者臨床病理特征無(wú)關(guān)系。
　　選擇擴(kuò)增靶基因Pak2 CDS區(qū)與miR-134結(jié)合位點(diǎn)附近序列，并成功構(gòu)建其熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒命名為pMIR-Pak2及其突變質(zhì)粒pMIR-Pak2mut。SKOV3-TR30細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-134 mimic和pMIR-Pak2（共轉(zhuǎn)染miR-134mimic和pMIR-Pak2-mut為對(duì)照組），通過熒光素酶報(bào)告基因方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-134與pMIR-Pak2

12、后（與pMIR-Pak2-mut相比），熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相對(duì)熒光值顯著降低（0.6779±0.11083 vs.1.0792±0.6924，P=0.01）。而在共轉(zhuǎn)染miRNA mimic NC與pMIR-Pak2（與pMIR-Pak2-mut相比），熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相對(duì)熒光值無(wú)明顯差異。由此證明miR-134與Pak2 CDS區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)及其直接結(jié)合作用。通過分別在SKOV3及SKOV3-TR30細(xì)胞中過表達(dá)及抑制miR-13

13、4表達(dá)，應(yīng)用real-time PCR及Western blot方法證實(shí)miR-134改變后，Pak2 mRNA水平無(wú)變化，而在蛋白表達(dá)水平改變。在SKOV3-TR30細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-134 mimic及pBI-Pak2（轉(zhuǎn)染miR-134mimic及pBI為對(duì)照組），通過CCK-8實(shí)驗(yàn)及凋亡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-134低表達(dá)狀態(tài)下對(duì)SKOV3-TR30促進(jìn)細(xì)胞增殖作用及凋亡抑制作用是通過Pak2實(shí)現(xiàn)的。通過在SKOV3-TR30細(xì)胞

14、中轉(zhuǎn)染miR-134mimic及Pak2過表達(dá)質(zhì)粒pBI-Pak2，在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134 inhibitor及Pak2 siRNA后，Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后凋亡通路蛋白Bad、Bad-ser112、Bad-ser136表達(dá)結(jié)果提示:Bad-ser112，Bad-ser136蛋白改變與Pak2呈正相關(guān)。
　　3、Sirt1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)miR-134在卵巢癌耐藥中的研究
　　免疫組化方法及Weste

15、rn blot方法檢測(cè)Sirt1在漿液性卵巢癌化療耐藥組織中表達(dá)較敏感組織中的表達(dá)顯著升高，且以胞核表達(dá)為主。Sirt1表達(dá)與卵巢漿液性癌組織化療與卵巢癌患者臨床病理特征無(wú)關(guān)系。ChIP方法證實(shí)，Sirt1與miR-134啟動(dòng)子區(qū)具有結(jié)合作用。通過分別在SKOV3及SKOV3-TR30細(xì)胞中過表達(dá)以及抑制Sirt1表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)miR-134表達(dá)呈相反趨勢(shì)。在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中Sirt1 mRNA表達(dá)顯著高于化療敏感卵

16、巢漿液性癌組織(P=0.032)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示30例卵巢癌組織中miR-134與Sirt1 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)。
　　結(jié)論：
　　1、miR-134在化療耐藥組織和紫杉醇耐藥細(xì)胞系中呈低表達(dá)且外源性升高miR-134表達(dá)可通過抑制細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞紫杉醇耐藥。
　　2、MiR-134轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Pak2基因，且Pak2通過促進(jìn)Bad蛋白ser112和s

17、er36位點(diǎn)磷酸化抑制細(xì)胞凋亡而可能參與卵巢癌化療耐藥。Pak2蛋白表達(dá)在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中顯著升高且與卵巢漿液性癌化療耐藥相關(guān)。Pak2 mRNA在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中表達(dá)與化療敏感卵巢漿液性癌組織中無(wú)顯著差異，且與miR-134表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性。
　　3、耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞中Sirt1通過轉(zhuǎn)錄水平負(fù)向調(diào)節(jié)miR-134表達(dá)。Sirt1在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中高表達(dá)且與卵巢漿液性癌化療耐藥相關(guān)。Sirt1mRN