流感病毒裂解疫苗工藝研究.pdf

1、流感病毒具有高度的傳染性，能引起急性呼吸道傳染疾病，流行特點(diǎn)是在短時(shí)間內(nèi)突然爆發(fā)，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部流行暴發(fā)及擴(kuò)散。其發(fā)病率極高，同時(shí)伴有很高的死亡率。目前尚無特效藥，接種流感疫苗是被公認(rèn)的預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最佳方法，用雞胚作為病毒生長(zhǎng)介質(zhì)也是目前流感疫苗生產(chǎn)最常用的培養(yǎng)基質(zhì)。 我們首先將來源于WHO流感參考和研究合作中心的H1N1、H3N2、B三種不同型別的流感病毒毒株分別接種于SPF級(jí)雞胚，

2、經(jīng)培養(yǎng)后，收獲其尿囊液，制備主代和工作種子批。將工作種子批接種來源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群雞胚進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，收獲病毒液，然后經(jīng)超濾濃縮、純化、裂解、滅活、二次純化等步驟，獲得三個(gè)型別的單價(jià)病毒液。在這過程中首先明確了適宜的毒種稀釋倍數(shù)和病毒收獲時(shí)間，然后摸索了蔗糖密度梯度離心純化應(yīng)該收集的病毒峰，并對(duì)工藝中裂解劑以及滅活劑的選用進(jìn)行了研究，確定了生產(chǎn)工藝。 選用兩種裂解劑Triton X100和Triton N101，以不

3、同濃度對(duì)流感病毒單價(jià)純化液作用，通過電鏡進(jìn)行裂解效果觀察，確定最佳裂解時(shí)間，用單向免疫擴(kuò)散法檢測(cè)HA含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明：Triton X100的裂解效果較優(yōu)越，0.5％～1％,Tdton X100作用90min可使流感病毒裂解。我們?cè)诒敬窝芯恐?，將二乙烯亞?Binarv Ethylene Imine，簡(jiǎn)稱BEI)引入制備流感病毒滅活疫苗當(dāng)中，與甲醛做對(duì)照， BEI的最佳滅活時(shí)間在24～36h之間，甲醛的為3h；BEI的滅活后的

4、免疫效果明顯優(yōu)于甲醛。運(yùn)用RT-PCR的方法測(cè)定出病毒8個(gè)基因滅活前后的變化，表明BEI滅活病毒的同時(shí)將8個(gè)基因序列完全破壞，而甲醛破壞不完全，從分子生物學(xué)水平證明經(jīng)BEI滅活的流感滅活疫苗更加安全、可靠。通過單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)兩種滅活劑的滅活效果做進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)雖然BEI滅活病毒的時(shí)間長(zhǎng)，但是其樣品中HA含量較甲醛滅活的高，但BEI能否用于人用疫苗的制備還需進(jìn)一步研究進(jìn)行大量的臨床實(shí)驗(yàn)。 本研究對(duì)使用雞胚培養(yǎng)流感病毒制備流感