發(fā)光桿菌雙元毒素PirAB的細(xì)胞毒性研究.pdf

1、發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）是一類格蘭陰性、與異小桿線蟲(chóng)（Heterorhabditis）共生、定殖于線蟲(chóng)腸內(nèi)的昆蟲(chóng)致病微生物。發(fā)光桿菌進(jìn)入靶標(biāo)昆蟲(chóng)血腔后，大量繁殖并釋放一系列毒素毒殺靶標(biāo)昆蟲(chóng)，主要四大類:毒素復(fù)合體(Tc)、致軟因子(Mcf)、發(fā)光桿菌毒力盒(PVC)和雙元毒素(PirAB)。其中，大部分毒素報(bào)道具有細(xì)胞毒性，其中Tc毒素通過(guò)一個(gè)與注射器類似的機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用，將毒素輸送至靶細(xì)胞。Mcf致

2、蟲(chóng)體軟化，使細(xì)胞骨架重排致其凋亡。PVC損害昆蟲(chóng)血細(xì)胞，使細(xì)胞骨架聚合。但是，有關(guān)PirAB細(xì)胞毒性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。PirAB雙元毒素不但對(duì)大蠟螟、小菜蛾等農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)具有口服和注射毒性，而且對(duì)岡比亞按蚊、尖音庫(kù)蚊、埃及伊蚊也表現(xiàn)出較高的毒殺作用。為了研究PirAB毒素的細(xì)胞毒性，探討其在抵抗昆蟲(chóng)體液免疫中發(fā)揮的作用，本研究異源表達(dá)了PirAB毒素，并對(duì)其細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究。
　　本研究以P.luminescens TT01菌株基因

3、組為模版，PCR擴(kuò)增了編碼PirAB毒素的基因plu4092-plu4093，連入表達(dá)載體pETDuet-1，構(gòu)建了表達(dá)載體pET-pirAB，轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli Rosetta(DE3)中。SDS-PAGE分析表明，PirAB毒素經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在Rosetta(DE3)中為可溶性表達(dá)。PirAB毒素經(jīng)Ni-NTA純化、透析脫鹽后，與樅色卷蛾中腸細(xì)胞CF-203孵育。MTT數(shù)據(jù)表明，PirAB雙元毒素對(duì)CF-203細(xì)胞的毒力呈現(xiàn)濃

4、度依賴性。孵育24h后，CF-203細(xì)胞的形態(tài)已不能保持完整的球形，細(xì)胞膜邊緣出現(xiàn)褶皺，且有內(nèi)容物滲出;臺(tái)盼蘭染色表明，PirAB毒素影響了細(xì)胞膜的通透性。激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比較，CF-203細(xì)胞的微管蛋白熒光強(qiáng)度大幅度減弱，推測(cè)PirAB毒素導(dǎo)致細(xì)胞微管的解聚，微管蛋白其潛在作用靶點(diǎn)。裂解CF-203細(xì)胞并提取基因組，發(fā)現(xiàn)DNA呈現(xiàn)片段化，表明PirAB毒素對(duì)細(xì)胞可能具有致凋亡作用。
　　本研究還構(gòu)建了Pi

5、rAB融合毒素，并對(duì)其毒性進(jìn)行了研究。plu4092基因和plu4093基因通過(guò)一段柔性接頭連接，置于cry1Ac基因啟動(dòng)子及終止子的調(diào)控下，構(gòu)建了PirAB融合毒素的表達(dá)載體pHT1AcPT-fusion。PirAB融合毒素在蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）無(wú)晶體突變株XBU001中能高效表達(dá)形成包涵體，包涵體經(jīng)發(fā)酵提純、溶解后，對(duì)甜菜夜蛾四齡幼蟲(chóng)具有注射毒力，能引發(fā)幼蟲(chóng)黑化，并導(dǎo)致其死亡。
　　本