鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白A1S-0115A的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是一種革蘭陰性非發(fā)酵桿菌，廣泛分布于水和土壤、醫(yī)院環(huán)境、人體腔道及皮膚表面，為院內(nèi)感染菌中，檢出率僅次于銅綠假單胞菌的條件致病菌。鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常規(guī)消毒處理具有較強(qiáng)的抵抗力，紫外線和一般消毒劑僅能抑制其生長(zhǎng)，不能將其殺滅[1]，因此，鮑曼不動(dòng)桿菌常藏匿于各種醫(yī)療器械及醫(yī)院病房角落，對(duì)于重癥患者，如老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長(zhǎng)期使用廣

2、譜抗生素治療的患者來(lái)說(shuō)，鮑曼不動(dòng)桿菌可成為重要的致病菌[2-4]。隨著廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑及各種侵入性治療的的廣泛應(yīng)用，在抗生素篩選壓力下，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)了多重耐藥(Multi-DrugResistance)，甚至泛耐藥(Pan-Drug Resistance)鮑曼不動(dòng)桿菌。泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（Pan-Drug Resistance Acinetobacter baumanii）對(duì)FDA推薦的所有用于治療Ab感染的抗生素耐藥

3、，包括頭孢菌素類、碳青霉烯類、beta-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氟喹諾酮類和氨基糖苷類。鮑曼不動(dòng)桿菌幾乎能夠入侵人體的各個(gè)器官和系統(tǒng)，引起醫(yī)院獲得性肺炎、泌尿生殖系統(tǒng)感染、傷口及皮膚感染、化膿性關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腹膜炎，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)嚴(yán)重?cái)⊙Y甚至死亡[5-6]，直接威脅國(guó)人的身體健康和公共衛(wèi)生安全。
　　加強(qiáng)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗將對(duì)有效控制鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性蔓延和臨床鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛感染

4、具有重大應(yīng)用價(jià)值。針對(duì)目前鮑曼不動(dòng)桿菌臨床上耐藥性急劇上升的狀況，利用鮑曼不動(dòng)桿菌的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的抗鮑曼不動(dòng)桿菌免疫反應(yīng)，是防治鮑曼不動(dòng)桿菌感染的一個(gè)新策略。目前針尚未有上市的或進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)的鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗的研究，但是實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)取得一些令人鼓舞的結(jié)果剛處于起步階段，如滅活的全菌疫苗[7-8]，外膜蛋白A（OmpA，最初稱為Omp38）[9-10]，外膜復(fù)合物[11]，外膜小泡[12]，生物膜相關(guān)蛋白[13]等疫苗均顯

5、示具有較好的免疫原性，可有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。然而目前的研究采用的全菌滅活疫苗及外膜復(fù)合物等，其成分比較復(fù)雜，可能含有效的保護(hù)性抗原成分，也可能存在與免疫保護(hù)無(wú)關(guān)或者副作用的成分，且制備過(guò)程難以標(biāo)準(zhǔn)化，而基因工程亞單位疫苗抗原成分明確，效果明確，副作用小，安全性高，是一種理想的疫苗形式。
　　鮑曼不動(dòng)桿菌感染致病存在多個(gè)環(huán)節(jié)，包括細(xì)菌的粘附，定植以及毒力因子釋放等環(huán)節(jié)。因此，理想的鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗應(yīng)含有分泌性毒素抗原或定植粘附

6、相關(guān)的蛋白，并且暴露于細(xì)菌表面，可以被免疫系統(tǒng)有效的識(shí)別，能夠有效刺激宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體，以發(fā)揮其調(diào)理吞噬或中和毒素的作用，保護(hù)宿主免于鮑曼不動(dòng)桿菌感染。此外，在制備抗原時(shí)，應(yīng)去除蛋白與免疫原性無(wú)關(guān)的冗余成分，降低機(jī)體的毒副反應(yīng)。因此，篩選鑒定有效的保護(hù)性抗原，是成功研制鮑曼不動(dòng)桿菌基因工程疫苗的前提和關(guān)鍵。
　　研究目的:
　　課題組前期通過(guò)反向疫苗學(xué)策略及生物信息學(xué)分析，從鮑曼不動(dòng)桿菌全基因組中篩選到了多個(gè)具有潛在免疫優(yōu)

7、勢(shì)的疫苗候選抗原。其中，A1S_0115為鮑曼不動(dòng)桿菌一個(gè)功能未知的外膜蛋白，且具有良好的保守性和特異性，為了實(shí)驗(yàn)研究該蛋白的免疫原性及免疫保護(hù)性，探討該蛋白作為鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗候選抗原的可能性，本研究通過(guò)基因克隆及表達(dá)鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_0115蛋白胞外區(qū)(A1S_0115A)活性片段作為疫苗的候選抗原，評(píng)價(jià)該抗原在小鼠全身鮑曼不動(dòng)桿菌感染動(dòng)物模型中的免疫保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)該候選抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。以期為新型、

8、有效的鮑曼不動(dòng)桿菌基因工程疫苗的分子設(shè)計(jì)，抗原選擇，以及后續(xù)的重組亞單位疫苗研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。
　　研究方法:
　　1.從鮑曼不動(dòng)桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17978中提取細(xì)菌基因組作為PCR的模板，經(jīng)生物信息學(xué)分析后，通過(guò)PCR擴(kuò)增鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_0115胞外區(qū)活性片段（命名為:A1S_0115A），同時(shí)引入酶切位點(diǎn)BamHⅠ與NotⅠ。目的基因雙酶切后的回收產(chǎn)物與pGEX-6P-2表達(dá)載體相連，轉(zhuǎn)化到Esche

9、richia coli XL-1 blue菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)GST融合蛋白，經(jīng)GST親和填料初純、柱層析精純及去內(nèi)毒素后，檢測(cè)蛋白終產(chǎn)物的純度并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
　　2.為評(píng)價(jià)候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫原性，采用ELISA在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)了候選疫苗抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體水平及其亞型，并繪制抗體消長(zhǎng)曲線。
　　3.為評(píng)價(jià)候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫保護(hù)作用，在通過(guò)腹腔感染鮑曼

10、不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17978，建立BALB/c小鼠膿毒血癥動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，將候選疫苗抗原A1S_0115A與Al(OH)3佐劑吸附后免疫BALB/c小鼠，并用組氨酸疫苗稀釋液及Al(OH)3佐劑作為空白對(duì)照及佐劑對(duì)照。小鼠在末次免疫后兩周，用LD80劑量的鮑曼不動(dòng)桿菌17978菌株(4.2×108CFU)感染小鼠，在細(xì)菌攻毒后的7天監(jiān)測(cè)小鼠的死亡情況，并計(jì)算免疫保護(hù)率，同時(shí)監(jiān)測(cè)感染后各臟器的細(xì)菌定植量與病理?yè)p傷。
　　4.為初

11、步研究候選疫苗抗原A1S_0115A的免疫保護(hù)作用機(jī)制，體外檢測(cè)了特異性抗體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬殺菌作用，體內(nèi)評(píng)價(jià)A1S_0115A特異性抗體的被動(dòng)免疫保護(hù)效果。同時(shí)檢測(cè)了免疫小鼠在感染鮑曼不動(dòng)桿菌后血清中的促炎因子(IL-1β、GM-CSF)及脾細(xì)胞中細(xì)胞因子(IFN-Υ，IL-4)的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建基因工程菌pGEX-6P-2-A1S_0115A/XL-1blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，候選疫苗蛋白A1

12、S_0115A以可溶形式表達(dá)在工程菌胞周質(zhì)中，經(jīng)GST親和填料初純、柱層析精純及去內(nèi)毒素后，目的蛋白純度高于95％，SDS-PAGE分析其蛋白分子量與預(yù)期大小一致。
　　2.候選疫苗抗原A1S_0115A以D0、D7、D14的免疫程序免疫BALB/c小鼠后，小鼠產(chǎn)生了特異的的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)為1∶256000，特異性抗體亞型主要以IgG1為主。在末次免疫后3個(gè)月的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，A1S_0115A特異性抗體水平逐步

13、上升并保持穩(wěn)定，具有相對(duì)良好的免疫持久性。
　　3.采用已建立的鮑曼不動(dòng)桿菌感染BALB/c小鼠的膿毒血癥動(dòng)物模型，將A1S_0115A候選疫苗免疫小鼠后，LD80致死劑量的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行攻毒感染，與佐劑對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，免疫組小鼠的生存率明顯提高，其保護(hù)率存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);各臟器的細(xì)菌定植量檢測(cè)與病理?yè)p傷結(jié)果表明，疫苗能顯著減少感染細(xì)菌在脾臟，腎臟，心臟，肝臟，肺臟中的定植，同時(shí)免疫組小鼠的病理?yè)p傷和

14、組織炎癥浸潤(rùn)亦低于對(duì)照組，免疫組小鼠的臨床評(píng)分明顯高于各對(duì)照組。
　　4.體內(nèi)外的抗體活性及功能檢測(cè)結(jié)果表明:純化的特異性A1S_0115A抗體在體外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌具有明顯的調(diào)理吞噬殺菌作用，在體內(nèi)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的感染具有良好的被動(dòng)免疫保護(hù)效果。免疫小鼠在感染鮑曼不動(dòng)桿菌后的細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明:疫苗組脾細(xì)胞的IFN-Υ及IL-4表達(dá)水平明顯高于各對(duì)照組(p＜0.05)，而血清中的促炎因子IL-1β及GM-CSF表達(dá)水平，疫苗組較

15、各對(duì)照組相比則顯著降低(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pGEX-6P-2-A1S_0115A/XL-1 blue基因工程菌，并表達(dá)制備了高純度的鮑曼不動(dòng)桿菌候選疫苗抗原A1S0115A。該抗原免疫小鼠后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了高效價(jià)的保護(hù)性抗體，對(duì)于致死劑量的鮑曼不動(dòng)桿菌感染具有良好的免疫保護(hù)作用。表明該候選抗原具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)性。
　　2.初步的免疫保護(hù)作用機(jī)制研究結(jié)果表明:該候選疫苗抗原免疫后可刺