鮑曼不動桿菌外膜蛋白W在臨床分離株中的表達(dá)及其致病性研究.pdf

1、目的：以鮑曼不動桿菌臨床分離株為研究對象，研究外膜蛋白W（OmpW）在不同臨床分離株中的表達(dá)是否存在差異；同步克隆表達(dá)重組蛋白OmpW并對其體外致病特征進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步闡明多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制和尋找抗感染靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和思路。
　　方法：1.人工合成多肽抗原，通過動物免疫得到抗血清，獲取抗OmpW蛋白多克隆抗體，鑒定后純化該多克隆抗體。2.選取臨床分離的碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌31株（耐藥組）及碳青霉烯

2、類抗生素敏感株30株（敏感組），通過蛋白印跡法（Western Blot）檢測2組分離株中OmpW蛋白表達(dá)情況。3.以鮑曼不動桿菌臨床株A1和標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19606為模板，通過PCR方法擴(kuò)增ompW和ompA基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)測序驗(yàn)證后，篩選陽性克隆表達(dá)重組蛋白OmpW和OmpA進(jìn)行蛋白純化。4.重組蛋白OmpW和OmpA分別與人喉癌細(xì)胞株Hep-2進(jìn)行培養(yǎng)，同步采用JC-1和DAPI熒光染料檢測Hep-2細(xì)胞凋亡情況。

3、r>　　結(jié)果：1.人工偶聯(lián)多肽的藍(lán)色載體構(gòu)建成功，經(jīng)臨床分離鮑曼不動桿菌菌體蛋白驗(yàn)證，在抗血清中得到抗OmpW蛋白的多克隆抗體。2.經(jīng)過Western Blot檢測，鮑曼不動桿菌耐藥組OmpW蛋白表達(dá)陽性率100％，敏感組的OmpW蛋白表達(dá)陽性率63.33%，耐藥組和敏感組OmpW蛋白表達(dá)量分布存在顯著差異，經(jīng)過Fisher確切概率法檢驗(yàn)，χ2=12.359，P=0.000<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.成功構(gòu)建原核表達(dá)載體，經(jīng)過基因

4、測序驗(yàn)證，在原核表達(dá)系統(tǒng)（pET30a/ompW、pET30a/ompA）中高表達(dá)，基因分子量分別為987bp和966bp，大小與預(yù)期值相符。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)尿素和Tris-HCl處理純化，得到高純度的重組蛋白OmpW和OmpA，分子量分別為42kD和41kD。4.在Hep-2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，外膜蛋白OmpW和OmpA與細(xì)胞作用后，JC-1染料檢測綠色熒光明顯增多，提示兩種蛋白都有誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡作用，DAPI染料檢測藍(lán)色熒光明顯增多，