重慶市仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型的外膜蛋白研究.pdf

1、致病性大腸桿菌是獸醫(yī)臨床上最常見的病原菌，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重危害。隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日益突出。為了有效預(yù)防該病，國內(nèi)外研制了各種類型的基因工程菌苗與多價滅活菌苗，但由于大腸桿菌的血清型復(fù)雜，各個地方的流行菌株各不相同，免疫效果并不理想，給大腸桿菌病的有效防制帶來很大困難。研究表明大腸桿菌的外膜蛋白(OMP)具有良好的免疫原性，可以加快巨噬細(xì)胞對抗原的攝取，激活淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，刺激機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，抵抗同

2、源菌和異源的攻擊。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離173株重慶市仔豬源致病性大腸桿菌，對其中的91株作了血清型鑒定，發(fā)現(xiàn)重慶市仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清為O101、O8、O20、O64、O45、O149，本次試驗(yàn)選取其中的仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型分離株O101、O8、O20外膜蛋白進(jìn)行研究，為今后開發(fā)研制豬源性大腸桿菌的外膜蛋白(OMP)亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。 1、重慶市仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型外膜蛋白(OMP)SDS-PAGE分析

3、 本研究選取仔豬源致病性大腸桿菌分離株O8、O20、O101(其中5株O8菌株，5株O20菌株，6株O101菌株)，用N-十二烷基肌氨酸鈉處理和超速離心技術(shù)相結(jié)合的方法提取外膜蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分析比較各株大腸桿菌外膜蛋白的差異性。結(jié)果表明：16株仔豬源大腸桿菌共出現(xiàn)了5種OMP型，5個O20分離株、5個O8分離株和6個O101分離株分別出現(xiàn)了2、3和2個OMP型。其中OMP-2型和OMP-3型同時存在于O8和O20分離株

4、中。 2、重慶市仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型分離株O8、O20、O101全菌蛋白和外膜蛋白(OMP)抗血清制備 用大腸桿菌分離株O8、O20、O101的全菌蛋白和外膜蛋白分別免疫青年健康家兔，第3次免疫后間隔7-10天進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散檢測，當(dāng)血清效價達(dá)1：16以上時，采血分離血清，通過間接EIJSA法測定抗體效價，結(jié)果表明：抗大腸桿菌分離株O8、O20、O101全菌蛋白的血清效價分別為1:2500、1:3000、1：300

5、0；抗大腸桿菌分離株O8、O20、O101外膜蛋白的血清效價分別為1:1500、1:2000、1:200。 3、重慶市仔豬源致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型外膜蛋白(OMP)免疫印跡分析 用全菌蛋白混合血清，對大腸桿菌外膜蛋白(OMP)進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明：大腸桿菌分離株O8、O20、O101外膜蛋白(OMP)均有免疫原性，16株大腸桿菌外膜蛋白(OMP)中7株(1株O8分離株，2株O20分離株和4株O101分離株)在免疫

6、印跡圖上出現(xiàn)1條免疫條帶，9株(4株08分離株，3株O20分離株和2株O101分離株)出現(xiàn)2-3條免疫條帶。其中11株(3株O8分離株，3株O20分離株和5株O101分離株)大腸桿菌外膜蛋白(OMP)在34kD左右具有共同的免疫條帶，4株(2株O8分離株和2株O20分離株)大腸桿菌外膜蛋白(OMP)在36kD左右具有共同的免疫條帶。 分別用抗大腸桿菌分離株O8、O20、O10l外膜蛋白(OMP)陽性血清，對大腸桿菌分離株O8、O

7、20、O101(各3株)外膜蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明：不同血清型外膜蛋白(OMP)與本型抗OMP陽性血清反應(yīng)時出現(xiàn)分子量大小一致的免疫條帶，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Maker和SDS-PAGE圖譜比較后，34kD左右分別是大腸桿菌分離株O8、O20、O101外膜蛋白(OMP)的免疫條帶；而不同血清型外膜蛋白(OMP)與抗本型以外的OMP陽性血清反應(yīng)時，只有少數(shù)的大腸桿菌分離株O8、O20、O101外膜蛋白(OMP)出現(xiàn)較弱的免疫條帶。