拮抗菌PY-1菌株的鑒定及對油菜菌核病防治潛能的評估.pdf

1、核盤菌是一種世界性分布的重要植物病原真菌，在我國嚴(yán)重威脅油菜生產(chǎn)。利用有益微生物控制核盤菌是目前菌核病防治研究的重點方向。本研究分離到一株對核盤菌有顯著拮抗活性的真菌PY-1菌株，并對其分類地位進(jìn)行了鑒定、對其控制油菜菌核病生防效果進(jìn)行了評估，對PY-1菌株產(chǎn)抗真菌物質(zhì)(AFS)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，初步明確了其所產(chǎn)AFS的特性，并對該AFS進(jìn)行了初步分離純化，結(jié)果如下： 1.拮抗菌PY-1菌株的鑒定：根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及ITS序列分析

2、，鑒定PY-1菌株為草酸青霉菌，在真菌界的分類地位上屬于絲孢子真菌，絲孢綱，絲孢目，青霉屬，而其有性代為子囊菌門，不整囊菌綱，散囊菌目，散囊菌屬真菌。 2.PY-1菌株對核盤菌作用機理：對峙培養(yǎng)試驗表明PY-1菌株對核盤菌的菌絲有強烈的拮抗作用，抑菌面積達(dá)9.6 cm<'2>， 2個月后觀察該抑菌面積仍不變。在20ml的PDA培養(yǎng)基中添加1ml的發(fā)酵液抑制核盤菌生長率為62.24％，其中1ml發(fā)酵液中的AFS相當(dāng)于4μg純的農(nóng)利

3、靈。另外研究還發(fā)現(xiàn)：PY-1菌株不能寄生菌核，對菌核的萌發(fā)沒有明顯的抑制作用，但可以降低菌核的產(chǎn)量。而且還可抑制核盤菌子囊孢子侵染油菜葉片。 3.PY-1菌株的誘導(dǎo)抗病性：將PY-1.菌株的孢子液(10<'7>個孢子/mL)和發(fā)酵液原液處理棉花根部后，分別在5d、7d、15d后接種炭疽病菌(CoIletotrichum gossypii)的孢子(10<'6>個/ml)，12d后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：處理5d后接種病原菌，對照的病情指數(shù)為30

4、.44，而孢子和發(fā)酵液處理的病情指數(shù)分別為16.13、14.50，相對防效分別達(dá)到47.02％、52.33％；處理7d后接種病原菌，對照的病情指數(shù)為22.95，而孢子和發(fā)酵液處理的病情指數(shù)分別為11.80、13.86，相對防效分別達(dá)到48.58％、39.65％；處理15d后接種病原菌，孢子液處理后的發(fā)病率僅為53％，其它兩個處理發(fā)病率為100％。對照病情指數(shù)為25.40，孢子和發(fā)酵液處理的病情指數(shù)分別為8.40、16.64，相對防效分別

5、達(dá)到66.92％、34.21％。結(jié)果表明PY-1菌株可誘導(dǎo)棉花對炭疽菌產(chǎn)生抗性。兩種誘導(dǎo)因子相比較而言，孢子液的誘導(dǎo)作用更好一些。 4.PY-1菌株對油菜菌核病的控制作用：(1)室內(nèi)離體葉片接種試驗表明：對照平均病斑直徑較大為4.07±0.68cm，用PY-1孢子(10<'7>個孢子/mL)處理后葉片發(fā)病率為75％，平均病斑直徑只有0.73±0.64cm。而用發(fā)酵液原液處理后，15片葉片中只有1片葉片發(fā)病，病斑直徑為1cm。(2

6、)盆栽試驗結(jié)果表明：PY-1菌株的孢子和發(fā)酵液對菌核病都有很好的控制作用，只接種核盤菌的油菜植株發(fā)病葉片數(shù)多，而且病斑直徑為2.80±0.5：經(jīng)PY-1菌株10<'7>的孢子處理后只有2片葉片發(fā)病，而用發(fā)酵原液處理后只有1片葉片發(fā)病。(3)2007年田間試驗結(jié)果表明PY-1菌株的孢子液(10<'7>個孢子/mL)和發(fā)酵液(稀釋5倍)對菌核病都具有一定的防效，兩個處理的病情指數(shù)要低于與對照處理病情指數(shù)，也較菌核凈處理的低。PY-1菌株的孢

7、子、發(fā)酵液以及菌核凈的相對防效分別為52.65％、39.48％、31.04％。 5.影響PY-1菌株產(chǎn)AFS因子的研究：(1)PY-1菌株AFS的產(chǎn)量與接種量、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基的起始pH值有關(guān)，最適的接種量為0.2-0.4.ml(10<'7>個孢子/mL!)，最適的發(fā)酵溫度為20℃，發(fā)酵最適的起始pH為4-5。研究還發(fā)現(xiàn)該菌對通氣量要求不高，搖瓶中裝30-100ml培養(yǎng)基都比較適宜AFS的產(chǎn)生。(2)以CMS為基本培養(yǎng)基進(jìn)行了碳

8、源、氮源的篩選，產(chǎn)生AFS最為適宜的碳源有蔗糖、甘露醇、甘油，最為適宜的氮源有精氨酸、花生餅粉、魚粉。此外，PDB培養(yǎng)基適合.pY-1菌株的生長和AFS的產(chǎn)生。(3)以PDB、CMS為基本培養(yǎng)基篩選到了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：KH<,2>PO<,4>，1.0g；MgSO<,4>.7H<,2>O,0.5g；CuSO<,4>.5H<,2>O,0.005g；KCL，0.5g；精氨酸，0.871g：蔗糖10.12g，蒸餾水至1000ml。同時還研究了該

9、菌的發(fā)酵代謝過程的一些代謝參數(shù)的變化，如pH，總糖，還原糖，氨基氮，菌絲生物產(chǎn)量等，AFS的產(chǎn)量在發(fā)酵第3d即可達(dá)到最高值。 6.PY-1菌株所產(chǎn)AFS的抗菌譜：抑菌譜測定試驗結(jié)果表明PY-1菌株所產(chǎn)的AFS對多種重要的植物病原真菌(如稻瘟菌、灰霉菌等)的抑制作用較強，而對水稻紋枯病菌、草莓白絹病菌等病原菌沒有拮抗作用，表明PY-1菌株所產(chǎn)生抗生物質(zhì)是一種抗真菌物質(zhì)，具有一定的選擇性。 7.PY-1菌株所產(chǎn)AFS的穩(wěn)定性

10、：將PY-1菌株的發(fā)酵液經(jīng)高溫(121℃)處理30min的時間后，仍有較高的抑菌活力，表明該AFS具耐高溫特性。酸堿穩(wěn)定性測定試驗表明該AFS在pH3-12范圍內(nèi)抑菌率變化幅度為52.17％-25.6％，在酸性條件下比較穩(wěn)定，在堿性條件下活性下降。將PY-1菌株發(fā)酵液的乙醚提取物經(jīng)紫外線照射2h后，抑菌活性提高的幅度為58.6％。發(fā)酵液在室溫存放一年后喪失抑菌活性。但在4℃存放一年后抑菌活性下降幅度為30.4％。表明PY-1菌株的AFS

11、可在4℃長時間存放。 8.PY-1菌株所產(chǎn)AFS初步鑒定：(1)八溶劑系統(tǒng)紙層析試驗結(jié)果表明，PY-1菌株所產(chǎn)的AFS是一種脂溶性的化合物，屬金色抗霉素類抗生物質(zhì)。pH紙層析實驗結(jié)果表明，pY-1菌株AFS在酸性區(qū)域和堿性區(qū)Rf值有兩個高峰，可知該AFS可能為一兩性抗生素類物質(zhì)。 9.PY-1菌株AFS的粗提?。?1)PY-1菌株發(fā)酵液粗提取物和菌絲提取物對核盤菌菌絲生長都有顯著的抑制作用，表明PY-1菌株的AFS胞內(nèi)胞

12、外均有產(chǎn)生。用極性較弱的有機溶劑乙酸乙酯、氯仿、乙醚等提取后效果較好，表明該AFS極性較低。進(jìn)一步研究表明最適提取比例為：發(fā)酵液：乙醚=4:3(V/V)。 10.PY-1菌株AFS的分離和純化：(1)通過薄層層析(TLC)，在展開劑乙酸乙酯：甲醇：水=100:10:1中可分離到3種物質(zhì),Rf值分別約為0.16，0.76，0.89。經(jīng)生物檢測Rf值0.89的物質(zhì)具有生物活性。(2)將經(jīng)過TLC精制后的樣品再利用高效液相色譜(HPL