油菜新型抗菌肽的篩選和一種油菜菌核病防治新策略的設(shè)計.pdf

1、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一種世界性的危害多種作物的重要植物病原菌，其寄主包括世界上主要的油料作物之一油菜，造成油菜的莖、葉和角果的腐爛，導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。目前雖然采用“以抗病品種為基礎(chǔ)、化學(xué)防治為加強措施，輔以其它防治方法”的油菜菌核病綜合防治措施，但至今為止還沒有發(fā)現(xiàn)完全免疫或者高抗的油菜品種，目前抗病品種的抗病水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到生產(chǎn)需求，而化學(xué)防治成本高、污染環(huán)境、花期人工噴藥困難，導(dǎo)致實際噴藥防

2、治面積很小，利用微生物源制劑的生物防治技術(shù)還未能在生產(chǎn)上推廣。油菜菌核病的有效防治需要開辟新的途徑，研發(fā)新的技術(shù)。
　　在油菜菌核病的侵染循環(huán)中，油菜葉和莖病斑的90％以上來自于花瓣介導(dǎo)的侵染，而角果的侵染主要由于與被侵染莖葉的接觸。如能阻止病原侵染花瓣或在花瓣中殺死病原菌，即能基本阻斷菌核病侵染循環(huán)，從而提高油菜菌核病的防控水平。針對這個侵染循環(huán)，本實驗室設(shè)計了一種技術(shù)路線，即利用花瓣作為生物反應(yīng)器，在其中特異、高量、持續(xù)、穩(wěn)定

3、地表達(dá)抑菌物質(zhì)，就地殺死病菌，達(dá)到阻止病害侵染循環(huán)、防治病害的目的。該生物反應(yīng)器的關(guān)鍵元件是:1）特異、高效、持續(xù)表達(dá)的油菜花瓣啟動子，2）高效的抑菌基因，3）表達(dá)產(chǎn)物的有效胞外運輸和抗降解能力。本文的研究集中在抗菌肽篩選和元件的組裝。主要結(jié)果如下。
　　1、油菜高效抗菌肽的篩選?？咕模ˋntimicrobial Peptides，AMPs）是一類具有抑菌活性的天然小分子蛋白，廣泛存在于生物界，是機體非特異性免疫的重要組成部分，

4、在體內(nèi)外均具有抑菌活性。本研究首先通過生物信息學(xué)的手段在油菜全基因組范圍內(nèi)進行抗菌肽基因的預(yù)測和分析，初步篩選出40個與已知抗菌肽具有類似序列結(jié)構(gòu)特征的候選基因。然后人工合成并純化，再裝入pET30a-EDDIE-GFP表達(dá)載體上，在大腸桿菌中表達(dá)。通過包涵體融合蛋白的體外復(fù)性和EDDIE的自我剪切，獲得不附加任何多余氨基酸的抗菌肽產(chǎn)物。通過抑菌活性檢測實驗篩選出32個對細(xì)菌具有強抑菌活性的抗菌肽基因，24個對核盤菌具有較強的抑菌活性。

5、
　　2、一個新型油菜脯氨酸富集類抗菌肽的獲得。脯氨酸富集類抗菌肽最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲和動物中，尚未在植物中發(fā)現(xiàn)這一類型的抗菌肽基因。本研究首次在植物中發(fā)現(xiàn)了脯氨酸富集類抗菌肽基因，其編碼的35個氨基酸序列中含有13個脯氨酸，脯氨酸含量大于35％，我們將它命名為BnPRP1，BnPRP1與來源于豬的脯氨酸富集類抗菌肽SP-B同源性為40.5％，同時在油菜中發(fā)現(xiàn)四個同源性序列，在油菜親本種白菜和甘藍(lán)中各發(fā)現(xiàn)兩個同源性序列。圓二色譜結(jié)果顯示

6、BnPRP1二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主，含有少量α-螺旋結(jié)構(gòu)。抑菌活性檢測實驗發(fā)現(xiàn)BnPRP1具有較強抗細(xì)菌和抗真菌活性，對核盤菌具有較強的抑菌活性。qRT-PCR檢測了BnPRP1基因表達(dá)是否受病原侵染的影響（誘導(dǎo)或抑制或不受影響）。結(jié)果顯示BnPRP1基因的表達(dá)受病原侵染的影響。在核盤菌接種后48h，感病品種中表達(dá)量顯著提高，而在抗病品種中呈現(xiàn)小幅的下降。這些結(jié)果表明BnPRP1基因可能在油菜菌核病防御反應(yīng)中發(fā)揮了一定的作用。

7、>　　3、花瓣生物反應(yīng)器初步組裝。基于上述思路，首先利用35S啟動子、前人已研究較為透徹的蘿卜抗菌肽基因Rs以及文獻(xiàn)報道的水稻α-淀粉酶信號肽αAmy3SP為元件，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果表明所克隆的蘿卜抗菌肽基因Rs和信號肽αAmy3SP基因大小正確，用信號肽+GFP的實驗表明信號肽能將GFP準(zhǔn)確定位到細(xì)胞間隙;轉(zhuǎn)擬南芥實驗結(jié)果表明，4個轉(zhuǎn)基因純系的Rs表達(dá)量均顯著增加;抗病鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥對菌核病的抗性顯著增加，同時目標(biāo)

8、基因的過表達(dá)不影響植株的正常生長與發(fā)育。接著以本實驗室發(fā)現(xiàn)的高效、特異（基于轉(zhuǎn)錄組測序和GUS結(jié)果）的油菜花瓣啟動子P76247、蘿卜抗菌肽基因Rs以及信號肽αAmy3SP為基本元件，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果表明，Rs在花中表達(dá)量最高（相對于Actin基因表達(dá)量），顯著高于葉和莖，也顯著高于35S驅(qū)動的該基因在花、葉和莖中的表達(dá)量。盡管花瓣的抑菌或抗病效果檢測尚未完成，但基于其在花中的高表達(dá)和35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因抗病性結(jié)果，可預(yù)期