類(lèi)鼻疽桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白BPSS1395的重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:
　　類(lèi)鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei，B.pseudomallei，簡(jiǎn)稱類(lèi)鼻疽桿菌）作為一種正在擴(kuò)散的人獸共患傳染病病原菌，能夠?qū)е路Q為類(lèi)鼻疽(melioidosis)的熱帶醫(yī)學(xué)疾病，病死率高達(dá)40％。由于類(lèi)鼻疽桿菌可在人體潛伏數(shù)十年后發(fā)病，故類(lèi)鼻疽也被稱為“不定時(shí)炸彈”。
　　細(xì)菌分泌系統(tǒng)在其致病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type threesecretion sy

2、stem，T3SS)。BPSS1395基因定位于類(lèi)鼻疽桿菌的T3SS，目前功能未知。通過(guò)生物信息學(xué)和BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)與之同源性較高的蛋白是青枯桿菌的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HrpF(hypersentive response and pathogenicity F)，屬于其T3SS效應(yīng)蛋白。我們推測(cè)BPSS1395可能是類(lèi)鼻疽桿菌T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)和定向元件。因此，本研究擬通過(guò)基因工程技術(shù)重組表達(dá)具有生物活性的BPSS1395蛋白并制備其抗體，確

3、定其亞細(xì)胞定位;同時(shí)，構(gòu)建類(lèi)鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除株，通過(guò)感染番茄植株證實(shí)BPSS1395在類(lèi)鼻疽桿菌感染植物中的重要作用。以上實(shí)驗(yàn)將為深入研究類(lèi)鼻疽桿菌作為一種潛在的植物病原造成人的感染和傳播作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用PCR擴(kuò)增類(lèi)鼻疽桿菌BPSS1395基因，目的基因與pET-22b載體質(zhì)粒通過(guò)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE

4、3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性重組子，經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證。
　　2.篩選得到的陽(yáng)性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并鑒定其表達(dá)形式，洗滌BPSS1395蛋白包涵體，通過(guò)復(fù)性得到可溶的BPSS1395蛋白。
　　3.以復(fù)性BPSS1395蛋白免疫家兔，制備抗BPSS1395血清;Western blot、ELISA及免疫熒光分析其免疫學(xué)性質(zhì)。
　　4.通過(guò)超速離心機(jī)分離全菌各組分，Western blot分析BPSS13

5、95蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　5.利用同源重組技術(shù)構(gòu)建類(lèi)鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除菌株:PCR擴(kuò)增類(lèi)鼻疽桿菌BPSS1395基因上下游同源臂，連接至pK18mobSacB自殺質(zhì)粒上，通過(guò)大腸桿菌S17-1λpir以接合方式將其轉(zhuǎn)入類(lèi)鼻疽桿菌中，而后蔗糖篩選獲得基因敲除突變菌株，PCR、DNA測(cè)序鑒定敲除菌株。
　　6.類(lèi)鼻疽桿菌野生株、BPSS1395基因敲除菌株和EHEC O157∶H7對(duì)照組分別感染番茄植株根部，觀察

6、植株及葉片的生長(zhǎng)情況，PCR鑒定植物基因組中的細(xì)菌，電鏡觀察植株葉片病理學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1.PCR獲得了全長(zhǎng)870bp BPSS1395目的基因，構(gòu)建了表達(dá)重組質(zhì)粒的陽(yáng)性工程菌pET-22b-BPSS1395/BL21(DE3)。
　　2.陽(yáng)性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體洗滌、復(fù)性獲得了分子量為32kDaBPSS1395重組蛋白。
　　3.該蛋白免疫家兔抗血清ELISA效價(jià)達(dá)1∶1280000，并能

7、與目的蛋白及類(lèi)鼻疽桿菌全菌發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。
　　4.BPSS1395蛋白在類(lèi)鼻疽桿菌中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　5.成功構(gòu)建了類(lèi)鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除突變菌株。
　　6.類(lèi)鼻疽桿菌野生株和BPSS1395基因敲除株分別感染番茄植株后，雖然野生株與敲除株感染后葉片未見(jiàn)明顯變化，但是電鏡觀察發(fā)現(xiàn)野生型感染組植物葉片的組織結(jié)構(gòu)中有類(lèi)鼻疽桿菌存在，同時(shí)PCR擴(kuò)增出特異性類(lèi)鼻疽桿菌基因，而敲除株感染組沒(méi)有。