類鼻疽菌重要毒素分子BLF1的重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei，簡(jiǎn)稱類鼻疽菌）是一種革蘭陰性桿菌，主要存在于水或土壤中，可經(jīng)由呼吸道吸入、消化道攝入、皮膚侵入等方式進(jìn)行傳播，主要侵犯人體肺部，可引起以肺炎、肺部空洞及肺部膿腫為特點(diǎn)的類鼻疽病，還可導(dǎo)致皮膚、腎臟、肝臟等多器官膿腫，嚴(yán)重者還可能發(fā)展為急性敗血癥而導(dǎo)致死亡。類鼻疽作為一種新發(fā)現(xiàn)傳染病，診斷困難、致病性強(qiáng)、臨床用藥治療困難，并且潛伏期較長(zhǎng)，流行地區(qū)死亡率高達(dá)40％;其流

2、行區(qū)域主要分布在南、北緯二十度內(nèi)，涵蓋新加坡、澳大利亞、越南、柬埔寨、馬來(lái)西亞、老撾、泰國(guó)東北部等地區(qū)以及我國(guó)香港、臺(tái)灣、廣東、海南等地區(qū)，越來(lái)越多的證據(jù)表明它是一種正在全球擴(kuò)散的人獸共患傳染病，目前尚無(wú)批準(zhǔn)使用的有效類鼻疽疫苗，因此亟待加強(qiáng)類鼻疽的相關(guān)研究。
　　毒力因子在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，類鼻疽菌的毒力因子主要有Ⅲ型分泌系統(tǒng)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)、莢膜多糖、鞭毛、菌毛、群體感應(yīng)分子、脂多糖等。2011年被發(fā)現(xiàn)的類鼻疽伯克霍爾

3、德菌致死因子1(Burkholderia lethal factor1，BLF1)，由bpsl1549基因編碼，結(jié)構(gòu)類似于大腸桿菌的細(xì)胞毒力因子CNF1-C，主要通過(guò)抑制eIF4A解旋酶的活性干擾蛋白質(zhì)的翻譯起始階段，引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的改變，并最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡。類鼻疽的死亡率較高，而B(niǎo)LF1作為類鼻疽菌第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的致死因子，其重要性不言而喻，獲取該毒素對(duì)研究其致病機(jī)制以及指導(dǎo)類鼻疽的診斷和防治具有重要意義。
　　近年來(lái)，

4、隨著蛋白合成抑制劑在抗腫瘤治療方面的效果逐漸被認(rèn)可，人們對(duì)蛋白質(zhì)翻譯起始因子eIF4A的抑制劑在靶向抗腫瘤治療中應(yīng)用的關(guān)注度也越來(lái)越高。BLF1作為潛在的eIF4A解旋酶活性抑制劑，能夠抑制蛋白質(zhì)的合成。那么可以設(shè)想，如果將該毒素遞送至腫瘤細(xì)胞后，毒素是否具有廣譜殺傷腫瘤細(xì)胞的作用呢？目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)的研究報(bào)道。
　　本研究的主要目的是通過(guò)基因工程技術(shù)重組表達(dá)BLF1(rBLF1)蛋白，并初步研究BLF1對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為

5、該蛋白在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.以BPC006菌株的全基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增bpsl1549基因，目的基因與pGEX-6P-2載體質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行BamHI/XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗性LB平板篩選陽(yáng)性克隆，雙酶切及DNA測(cè)序驗(yàn)證。
　　2.IPTG誘導(dǎo)陽(yáng)性重組子表達(dá)GST-BLF1融合蛋白，親和層析純化融合蛋白并經(jīng)PSP酶酶切后獲

6、得rBLF1蛋白。以純化rBLF1蛋白免疫新西蘭兔，制備抗BLF1血清，并通過(guò)Western blot及ELISA法鑒定。
　　3.A549細(xì)胞模型中，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)研究目的蛋白的細(xì)胞毒性效應(yīng)及抗體阻斷作用。不同濃度rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠，觀察小鼠生存率。
　　結(jié)果:
　　1.從類鼻疽菌基因組DNA中PCR得到了編碼BLF1的目的基因，并通過(guò)pGEX-6P-2載體成功構(gòu)建了高效表達(dá)BLF1的工程菌株

7、。
　　2.經(jīng)過(guò)二步親和層析得到了分子量為23kD的高純度rBLF1，將純化蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清，ELISA效價(jià)達(dá)1∶1280000，Western blot鑒定在目的蛋白位置處出現(xiàn)特異印跡條帶。
　　3.rBLF1蛋白能明顯殺傷A549細(xì)胞，抗體可有效阻斷其殺傷作用。
　　4.rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠，小鼠死亡率隨蛋白劑量的增加而升高，同時(shí)正常小鼠對(duì)低劑量BLF1表現(xiàn)出一定的耐受性。
　　結(jié)