釀酒酵母ChIFN重組工程菌的生物學(xué)活性及飼用安全性研究.pdf

1、本研究以攜帶雞α干擾素（ChIFN-α）和雞γ干擾素（ChIFN-γ）編碼基因的釀酒酵母重組工程菌株INVSc1/pYE-IFNR、INVSc1/pYE-IFNG為材料，經(jīng)鑒定分析和誘導(dǎo)重組干擾素蛋白表達(dá)后，通過真空冷凍干燥法制備活性酵母干粉，進(jìn)一步對(duì)其抗病毒活性、營養(yǎng)價(jià)值及毒理安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)研究，為開發(fā)能夠用于禽病防治的高活性、營養(yǎng)豐富和安全的飼料微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.釀酒酵母重組工程菌株的鑒定和

2、遺傳穩(wěn)定性分析。分別通過菌落PCR、基因組PCR、Southern blot、SDS-PAGE、ELISA和質(zhì)譜等技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保種的ChIFN-α、ChIFN-γ兩種重組釀酒酵母基因工程菌進(jìn)行鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。結(jié)果表明，外源ChIFN-α基因和ChIFN-γ基因在INVSc1/pYE-IFNR和INVSc1/pYE-IFNG工程菌株中穩(wěn)定存在，并分別在宿主基因組中以1拷貝和2拷貝進(jìn)行插入；工程菌能有效表達(dá)和累積重組蛋白，rCh

3、IFN-α和rChIFN-γ的分子量分別為40.1 KDa和39 KDa，最高表達(dá)量分別為43.20 ng/L和44.29 ng/L。
　　2.建立活性酵母干粉的真空冷凍干燥制備工藝。通過二水平因子試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，對(duì)冷凍干燥保護(hù)劑、干燥時(shí)間及溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了高活性酵母干粉的真空冷凍干燥制備工藝：發(fā)酵誘導(dǎo)16 h→離心（4℃，5,000 r/min，10 min）收集菌泥→添加復(fù)合保護(hù)劑（14.44 g/100mL蔗糖

4、、10.08 g/100mL脫脂奶粉和1.11 g/100mL聚乙二醇）→-80℃預(yù)凍2 h→低溫真空干燥8 h（-80℃、3～10 Pa）→刮粉粉碎。利用該工藝制備的酵母含水量為5.63％，成粉質(zhì)量好、復(fù)水后菌體形態(tài)正常，細(xì)胞存活率達(dá)80.81%。
　　3.重組工程菌的生物學(xué)活性鑒定。利用雛雞-新城疫病毒（NDV）動(dòng)物活體攻毒系統(tǒng)進(jìn)行ChIFN-α、ChIFN-γ兩種釀酒酵母重組工程菌粉的抗病毒活性檢測(cè)。當(dāng)NDV病毒的HA效價(jià)增

5、值到29、雛雞體內(nèi)母源抗體效價(jià)低于24時(shí)（15日齡）進(jìn)行攻毒。工程菌粉的日糧添加比例為0.3%，喂養(yǎng)不同時(shí)間后，進(jìn)行NDV皮下注射攻毒。20d的試驗(yàn)期結(jié)果表明，飼喂ChIFN-α或ChIFN-γ釀酒酵母重組工程菌組NDV抗體效價(jià)高于對(duì)照組；ChIFN-α和ChIFN-γ兩種釀酒酵母重組工程菌粉均對(duì)感染病毒的雛雞具有保護(hù)作用；當(dāng)同時(shí)添加兩種菌粉（添加比例為1:1，每日喂養(yǎng)量為0.3 g/羽）時(shí)保護(hù)效果最好，對(duì)雛雞的保護(hù)率可達(dá)71%?？诜?/p>

6、養(yǎng)ChIFN-α、ChIFN-γ兩種釀酒酵母重組工程菌粉可以提高雛雞的NDV病毒抗性。
　　4.重組工程菌粉的品質(zhì)和營養(yǎng)分析。根據(jù)國家飼料質(zhì)量檢測(cè)相關(guān)標(biāo)方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組工程菌具有釀酒酵母的正常形態(tài)特征，感官質(zhì)量良好；ChIFN-α、ChIFN-γ兩種釀酒酵母重組工程菌粉的含水量分別為5.6%和5.4%，復(fù)水后的活細(xì)胞數(shù)分別為266.395億個(gè)/g和267.854億個(gè)/g；其細(xì)菌總數(shù)、霉菌、沙門氏菌、鉛和總砷等微生物及重金屬含

7、量均符合國標(biāo)衛(wèi)生學(xué)要求，營養(yǎng)成分檢測(cè)分析表明，ChIFN-α工程菌粉的灰分、總糖、粗脂肪和粗纖維含量均高于野生型菌粉，其第一限制性氨基酸為苯丙氨酸+酪氨酸；ChIFN-γ工程菌粉的灰分、總糖、總磷、總鈣、總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量均高于野生型菌粉，其第一限制性氨基酸為苯丙氨酸+酪氨酸。兩種釀酒酵母重組工程菌粉的賴氨酸、和甲硫氨酸2種必需氨基酸的含量均高于野生型菌粉，第一限制性氨基酸為苯丙氨酸+酪氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸，該兩

8、種工程菌粉的蛋白模式不符合蛋白質(zhì)飼料要求。
　　5.重組工程菌粉的毒理安全性評(píng)價(jià)。通過最大耐受量法的急性毒理試驗(yàn)對(duì)ChIFN重組工程菌粉進(jìn)行安全性分析評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：ChIFN-α、ChIFN-γ兩種釀酒酵母重組工程菌粉對(duì)三黃雞的經(jīng)口急性毒性最大耐受劑量均大于13.33 g/kg體重，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，該兩種釀酒酵母重組菌粉屬于無毒。
　　綜上所述，釀酒酵母ChIFN重組工程菌具有良好的遺傳穩(wěn)定特性，能有效表